吴永琴，关存杰，刘洪茂，姬艳丽，徐德祥

镉诱导小鼠急性肝损伤模型的研究

吴永琴1，关存杰1，刘洪茂2，姬艳丽2，徐德祥2

摘要目的通过腹腔注射氯化镉（CdCl2）建立小鼠急性肝损伤模型，初步阐明其分子机制。方法以4 mg／kg CdCl2腹腔注射小鼠，观察各时间点小鼠肝组织病理变化和血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）的变化，探索CdCl2引起明显肝损伤的染毒时间；以1、2、4 mg／kg CdCl2对小鼠腹腔注射染毒，筛选出CdCl2诱导急性肝损伤的最佳染毒剂量；检测血清丙二醛（MDA）以及肝匀浆MDA、一氧化氮（NO）、谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）含量，观察氧化应激在CdCl2诱导的小鼠肝损伤中的作用。结果以4 mg／kg CdCl2腹腔注射18 h后，肝脏组织出现片状坏死，肝细胞严重气球样变，血清ALT和AST明显升高。此外，与对照组比较，CdCl2处理18 h后，血清与肝脏MDA及肝脏NO水平显著升高，肝脏GSH、GSH-PX活性明显降低。结论4mg／kg CdCl2腹腔注射18 h后可成功建立小鼠急性肝损伤模型，其发生可能与MDA和NO升高，肝组织GSH含量、GSH-PX活性降低相关。

关键词氯化镉；急性肝损伤；动物模型；MDA；NO；GSH

中毒性肝损伤是指药物、外源性毒物及其代谢产物引起的肝脏损伤性病变，临床上十分常见，发病率仅次于病毒性肝炎。目前常用的肝损伤动物模型包括三大类，即化学性肝损伤动物模型、免疫性肝损伤动物模型和药物性肝损伤动物模型［1－2］。目前化学性急性肝损伤模型的研究［3－6］以对乙酰氨基酚、四氯化碳、酒精等的研究较为详细，而对重金属导致的急性肝损伤模型研究较少。重金属诱导的肝损伤的分子机制可能与四氯化碳等诱导的肝损伤机制不同，对四氯化碳等诱导的肝损伤有效的保肝药物是否适用于重金属诱导的肝损伤也应该重新思考。镉对机体许多组织器官都具有毒性作用［7］，肝脏是急性镉暴露的主要靶器官之一。目前对镉诱导小鼠急性肝损伤的研究［8－11］在剂量和时间上差异较大，且动物品系、性别不同，所诱导的肝脏毒性也有所不同［12］。该研究对氯化镉（cadmium chloride，CdCl2）诱导的肝损伤进行动态观察，筛选合适的染毒剂量及最佳染毒时间，建立镉诱导的肝损伤模型，为进一步研究重金属诱导的肝损伤分子机制及筛选保肝药物提供参考依据。

1　材料与方法

1．1实验动物

健康清洁级ICR小鼠（6～8周龄，雄性，体重28～35 g）购自安徽省实验动物中心。实验前适应性喂养1周，自由饮食，昼夜均衡，温度20 ～25℃，湿度（50±5）%。实验遵循国家科学技术部条件财务司颁布的《中华人民共和国实验动物管理条例》，尽量减少实验动物使用数量和减少实验动物痛苦，禁止虐待动物。

1．2试剂

CdCl2购自美国Sigma公司；血清丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基转移酶 （aspartate aminotransferase，AST）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-PX）和一氧化氮（nitric oxide，NO）试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1．3动物处理

为动态观察CdCl2诱导的急性肝损伤，镉处理组小鼠以0．1 ml／10 g体重经腹腔注射4 mg／kg CdCl2，分别在处理6、12、18、24、48、72 h后剖杀。为探讨镉致小鼠急性肝损伤的剂量－效应关系，镉处理组小鼠经腹腔注射不同剂量的CdCl2（1、2、4 mg／kg），镉处理后18 h剖杀小鼠。正常对照组给予等容量生理盐水。阳性对照组经腹腔注射给予300 mg／kg对乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）并于4 h后剖杀［4］。收集血清用于生化指标检测；取肝脏称重后，取部分肝脏固定于 4%多聚甲醛溶液中，用于制备石蜡切片。其余肝脏组织储存于－80℃，用于生化指标检测。

1.4ALT、AST活力测定

采用改良赖氏比色法测定血清ALT、AST活力以评价肝脏损伤程度。遵

2015－05－08接收

1.5GSH含量及GSH-PX活力测定

采用Beutler改良法检测肝组织GSH含量，Lowry法测定肝组织蛋白含量。GSH-PX活力测定参照试剂盒说明。

1．6脂质过氧化测定

通过测定脂质过氧化的羰基产物MDA水平来反映肝组织的氧化应激水平，MDA含量测定采用TBARS比色法。NO采用化学法测定。

1.7肝脏组织HE染色

取小鼠完整未破损的肝脏组织块，置于4%多聚甲醛中固定。经无水乙醇溶液脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、5μm连续切片、HE染色、光学树脂封片，在光学显微镜下观察肝脏组织病理学变化并拍照，每组分别制备不同小鼠HE染色切片，由安徽医科大学第一附属医院病理科完成。

1．8统计学处理

2　结果

2．1急性镉暴露对雄性小鼠体重及肝脏重量的影响

在染毒观察期内没有小鼠死亡。4 mg／kg CdCl2处理12 h后小鼠体重及肝脏绝对重量明显下降，48 h后小鼠体重基本恢复，72 h后肝脏绝对重量恢复（F＝2．86、3．43，P＜0．05），见表1。不同剂量镉暴露对小鼠体重及肝脏重量的影响（F＝3．23、3．94，P＜0．05），见表2。与正常对照组比较，4 mg／kg CdCl2暴露18 h后小鼠的体重和肝脏重量明显下降。

表1　4mg／kg CdCl2对雄鼠体重、肝脏重量的影响（n＝6，±s）

表1　4mg／kg CdCl2对雄鼠体重、肝脏重量的影响（n＝6，±s）

与正常对照组比较：*P＜0．05，**P＜0．01

组别　　处理前体重（g）处理后体重（g）肝脏绝对重量（g）33．99±1．49　34．58±1．31　2．15±0．26 Cd－6 h　33．97±2．06　33．69±1．97　2．04±0．22 Cd－12 h　33．96±1．92　32．35±1．86*　1．72±0．09**Cd－18 h　34．46±2．41　32．04±1．74*　1．78±0．18**Cd－24 h　34．26±2．11　31．64±2．14*　1．59±0．12**Cd－48 h　34．42±3．50　32．36±3．64　1．71±0．26**正常对照Cd－72 h　33．47±3．43　32．45±3．67　1．83±0．36

表2　不同剂量　CdCl2对雄鼠体重、肝脏重量的影响（n＝6，±s）

表2　不同剂量　CdCl2对雄鼠体重、肝脏重量的影响（n＝6，±s）

与正常对照组比较：*P＜0．05，**P＜0．01

组别　　处理前体重（g）处理后体重（g）肝脏绝对重量（g）31．71±1．88　33．11±2．47　2．01±0．28 1 mg／kg CdCl2　31．35±2．53　31．91±2．79　1．62±0．35*2 mg／kg CdCl2　31．16±1．68　30．46±2．24*　1．69±0．18*4 mg／kg CdCl2　31．07±1．86　29．40±1．28**　1．65±0．14正常对照**

表3　4 mg／kg CdC l2对雄鼠血清ALT、AST的影响（n＝6，±s）

表3　4 mg／kg CdC l2对雄鼠血清ALT、AST的影响（n＝6，±s）

组别　ALT（U／L）　AST（U／L）20．25±4．16　22．33±6．48阳性对照　150．29±33．88**Cd－6 h　34．56±23．16　39．28±11．53 Cd－12 h　45．36±17．80**　48．83±12．37**Cd－18 h　222．12±119．9**　99．09±46．05**Cd－24 h　76．55±52．05*　56．35±15．04**Cd－48 h　45．50±17．19**　35．67±19．57 Cd－72 h　19．87±5．52　53．67±19．64正常对照**

与正常对照组比较：*P＜0．05，**P＜0．01

表4　不同剂量　CdC l2对雄鼠血清　ALT、AST的影响（n＝6，±s）

表4　不同剂量　CdC l2对雄鼠血清　ALT、AST的影响（n＝6，±s）

与正常对照组比较：*P＜0．05；**P＜0．01；与1 mg／kg CdCl2组比较：＃＃P＜0．01；与2 mg／kg CdCl2组比较：△△P＜0．01

组别　ALT（U／L）　AST（U／L）20．96±5．26　23．74±7．51 1 mg／kg CdCl2　29．73±17．09　38．47±11．58 2 mg／kg CdCl2　37．22±24．38　39．67±15．99*4 mg／kg CdCl2　148．56±45．37**＃＃　108．40±9．82正常对照**△△

2．2急性镉暴露对雄性小鼠肝脏组织病理学的影响

正常对照组肝组织切片显示肝小叶结构正常，肝细胞以中央静脉为中心，向周围呈放射状排列，肝索和肝血窦清晰可见；阳性对照组肝小叶结构破坏，出现片状坏死，肝窦淤血，肝细胞胞质淡染呈气球样变，胞核溶解，炎症细胞浸润。4 mg／kg CdCl2染毒后，肝组织病理损伤随时间先逐渐加重，以18 h最为严重，肝组织切片出现片状坏死，坏死区肝索紊乱，中央静脉和部分肝窦淤血，肝细胞肿大呈气球样变，胞质淡染疏松化，胞膜破坏及胞核碎裂，炎症细胞浸润。1 mg／kg CdCl2剂量组肝组织肝小叶结构仍然保持正常；2 mg／kg CdCl2剂量组肝细胞排列轻微错乱，部分区域出现肝细胞片状变性，炎症细胞轻微浸润。见图1、2。

2.3急性镉暴露对血清ALT与AST的影响

APAP处理4 h后血清中ALT明显升高，见表3。与正常对照组比较，4 mg／kg CdCl2处理12 h后血清ALT、AST明显升高，18 h达最高峰，在镉处理后24 h血清ALT、AST下降，72 h基本恢复正常（F＝4．89、4．43，P＜0．01）。此外，与正常对照组比较，1 mg／kg与2 mg／kg CdCl2仅引起ALT、AST的轻微升高，而4 mg／kg CdCl2处理18 h后的血清ALT、AST明显高于其它两个剂量组，差异有统计学意义（F＝15．6、50．2，P＜0．01）。见表4。

2．4急性镉暴露对小鼠肝脏氧化应激指标的影响

与正常对照组比较，镉暴露组小鼠血清MDA、肝脏MDA、肝脏NO水平随时间逐渐升高（F＝5．33、6．40、8．16，P＜0．01），而且具有剂量效应关系（F＝6．46、14．42、13．30，P＜0．01），4 mg／kg CdCl2处理18 h达到高峰；而GSH含量及GSH-PX活力随时间逐渐降低（F＝28．99、17．38，P＜0．01），于18 h达到最低点，72 h基本恢复正常，并具有剂量效应关系（F＝60．49、21．98，P＜0．01），见表5、6。

表5　4 mg／kg CdC l2对小鼠血清与肝脏氧化应激指标的影响（n＝6，±s）

表5　4 mg／kg CdC l2对小鼠血清与肝脏氧化应激指标的影响（n＝6，±s）

与正常对照组比较：*P＜0．05，**P＜0．01

组别　　血清MDA（nmol／ml） 肝脏MDA（μmol／gprot）　肝脏NO（μmol／gprot） 肝脏GSH（μmol／gprot）　　肝脏GSH-PX（U／L）正常对照　6．09±1．03　2．14±0．61　0．38±0．15　67．05±5．65　754．72±58．54 Cd－6 h　6．69±1．93　2．00±0．56　0．46±0．18　59．21±10．55*　692．23±36．97*Cd－12 h　10．02±3．03**　3．23±1．36**　0．65±0．22**　35．05±6．54**　601．48±27．06**Cd－18 h　10．54±1．87**　6．92±2．18**　1．17±0．39**　17．48±5．55**　529．41±37．40**Cd－24 h　8．63±1．55**　2．75±1．11　0．60±0．15**　38．63±6．28**　607．85±20．89**Cd－48 h　6．24±0．99　2．49±0．26　0．57±0．32　61．89±10．56　727．77±65．72 Cd－72 h　7．22±1．58　2．18±0．31　0．36±0．16　62．77±11．30　733．61±69．31

3　讨论

近年来，随着新药、新化学物质的不断出现和环境污染加剧，药物中毒性肝损伤的发病率呈明显上升趋势。中毒性肝损伤的发病机制非常复杂，对其肝损伤的分子机制目前尚不清楚。选择合适的肝损伤模型是探讨中毒性肝损伤的发病机制、做好防治肝损伤研究的前提。镉是环境中常见的有毒重金属元素，肝脏是镉急性中毒损伤的主要靶器官。本研究通过腹腔注射CdCl2建立小鼠急性肝损伤的模型。结果显示：4 mg／kg CdCl2腹腔注射18 h后引起小鼠肝脏出现明显的病理损伤，肝组织出现片状坏死区，肝细胞呈严重气球样变，中央静脉和肝窦淤血严重。

ALT和AST是一组催化氨基在氨基酸与α-酮酸间转移的酶，是反映肝实质损害的主要酶类。当肝细胞被破坏、细胞膜通透性增高及线粒体损伤时，ALT和AST活力升高，酶活力的高低与肝细胞受损的程度相一致。本研究显示：腹腔注射4 mg／kg CdCl2后，小鼠血清ALT、AST逐渐升高，18 h达到峰值，24 h明显下降，72 h基本恢复正常。4 mg／kg CdCl2处理18 h后的小鼠血清ALT、AST明显高于1、2 mg／kg剂量组。根据上述实验结果，单次腹腔注射4 mg／kg CdCl218 h后能够诱导成年雄性ICR小鼠发生急性肝损伤。

目前研究［2，12］显示镉离子对肝脏的毒性作用与氧化应激导致的脂质过氧化有关，镉离子消耗GSH，与分子巯基蛋白结合，引起活性氧化物如超氧阴离子、羟自由基、过氧化氢等的增多。MDA是脂质过氧化反应的主要产物，其含量的高低间接反应了机体细胞受自由基攻击的严重程度。GSH-PX是体内广泛存在的抗氧化酶，其活性的高低反映了机体抗氧化能力和清除自由基的能力，在细胞内起到保护细胞膜结构和功能完整的作用。GSH是有效的巯基抗氧化剂，能有效防止脂质过氧化，从而减轻氧化应激。本实验表明，在给予4 mg／kg CdCl212 h后小鼠血清与肝脏MDA升高，至染毒后18 h达峰值；而4 mg／kg CdCl2处理后肝脏GSH-PX活力与GSH水平显著降低，至18 h达最低值，并呈明显的时间－效应关系及剂量－效应关系。提示在本模型中，小鼠的肝脏受到了自由基的攻击程度比较严重，自身的抗氧化及清除自由基的能力下降。NO是一种重要的细胞内第二信使，对肝细胞具有双重作用，高浓度的NO通过多种机制导致肝细胞损伤或凋亡，也使肝细胞产生大量自由基，造成MDA升高［13－15］。本实验结果显示，单次腹腔注射4 mg／kg CdCl218 h后小鼠肝匀浆中NO的含量显著升高，提示镉引起肝脏氧化应激损伤。

综上所述，本研究显示，以4 mg／kg CdCl2腹腔注射18 h后可成功建立小鼠急性肝损伤模型，为探讨重金属类毒物诱导肝损伤的发生机制、筛选保肝药物、探索保肝作用机制提供了实验动物模型。

表6　不同剂量　CdC l2对小鼠血清与肝脏氧化应激指标的影响（n＝6，±s）

表6　不同剂量　CdC l2对小鼠血清与肝脏氧化应激指标的影响（n＝6，±s）

与正常对照组比较：*P＜0．05，**P＜0．01

组别　　血清MDA（nmol／m l）肝脏MDA（μmol／gprot）肝脏NO（μmol／gprot）肝脏GSH（μmol／gprot）　　肝脏GSH-PX（U／L）8．17±52．42 1 mg／kg CdCl2　7．10±1．68　1．93±0．62　0．43±0．33　50．12±8．70*　683．80±58．22 2 mg／kg CdCl2　7．85±1．83*　1．92±0．82　0．81±0．44*　40．31±6．56**　595．66±33．59**4 mg／kg CdCl2　10．00±1．66**　6．84±1．26**　1．15±0．31**　19．91±5．00**　525．16±41．34正常对照　6．13±0．76　1．88±0．32　0．36±0．11　66．09±6．05　72 **

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中图分类号R 854；R 575

文献标志码A

文章编号1000－1492（2015）10－1443－05

基金项目：国家自然科学基金（编号：31000664）；安徽医科大学2011年博士科研资助项目（编号：XJ201114）；安徽医科大学“青年拔尖人才支持计划”，高等学校省级特色专业建设点项目（编号：2013tszy010）

作者单位：安徽医科大学1第一临床医学院，2公共卫生学院，合肥230032

作者简介：吴永琴，男，本科生；姬艳丽，女，副教授，硕士生导师，责任作者，E-mail：jiyanlidev＠126．com照试剂盒说明书进行操作。

Establishment ofmousemodel of acute liver injury induced by cadm ium chloride

Wu Yongqin1，Guan Cunjie1，Liu hongmao2，et al （1The First School of Clinical，2School of Public Health，Anhui Medical University，Hefei230032）

AbstractObjectiveTo establish themousemodel ofacute liver damage induced cadmium chloride and elucidate themechanism of Cd-induced-liver injury．MethodsThe adultmale mice were intraperitoneally（i．p．）injected with a single dose of CdCl2（4 mg／kg）and killed at different time（6，12，18，24 h）after Cd treatment，or administrated with different doses of CdCl2（1，2 or 4 mg／kg）i．p．and sacrificed at18 h after Cd exposure．The control group received only equal volumes of normalsaline．Histopathology of liver tissues，serum of ALT，AST and MDA，and MDA，NO，GSH，GSH-PX of liver tissues were observed．Resu lts18 hours after the treatment of using 4 mg／kg dosage，i．p，liver tissues appeared visible pathological changes with severe ballooning degeneration and necrosis，the levels of ALT and AST in serum were obviously higher．In addition，at18 h after Cd treatment，the levels of MDA and NO in liver tissues significantly increased in the cadmium group，however，the level of GSH and the activity of GSH-PX in liver tissues significantly decreased．ConclusionA mouse model of acute liver injury is successfully established by intraperitoneal injection with 4 mg／kg CdCl2at18 hours after Cd treatment．Themechanism might be associated with the increase of MDA and NO and the decrease of the level of GSH and the activity of GSH-PX in liver tissues．

Key wordscadmium chloride；acute liver injury；animalmodel；MDA；NO；GSH