余　庆，许　曼，赵倩茹，林元节，陈　伟，金　涌

大鼠非酒精性脂肪肝病程中细胞色素P450酶的分析

余庆，许曼，赵倩茹，林元节，陈伟，金涌

摘要目的探讨4种主要的细胞色素P450酶在非酒精性脂肪肝（NAFLD）发病进程中的表达变化。方法建立大鼠NAFLD的病理模型，并分别测定肝匀浆中谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）和三酰甘油（TG）等生化指标。采用Western blot法检测在各个病理时期CYP1A2、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A1的表达水平的变化。结果随着NAFLD严重程度的增加，AST与ALT的活性显著上升（P＜0．01），TG的水平则在重度脂肪肝时期之前上升，而后显著下降（P ＜0．01）。CYP1A2和CYP2D6的表达水平在发病进程中总体呈下降趋势，CYP3A1虽总体下调，但幅度不大，而CYP2E1的表达水平则明显上升（P＜0．01）。结论在NAFLD的发病进程中CYP1A2、CYP2D6、CYP3A1和CYP2E1的表达水平发生明显的改变，实验结果可以为内科医师针对NAFLD患者的用药提供指导。

关键词非酒精性脂肪肝；细胞色素P450酶；肝匀浆；蛋白表达

非酒精性脂肪肝（non－alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一种并非由于过度饮酒、自身免疫、药物感染等因素所导致的一种以弥漫大泡性脂肪为主要特征的临床病理综合征。其包括良性的肝脏脂肪变性、由其演变的非酒精性脂肪性肝炎和肝硬化，并最终有可能导致肝脏功能障碍［1－2］。NAFLD的常见病因有肥胖、药物损伤、高脂血症与糖尿病等。NAFLD的病理过程非常复杂，涉及体内的众多角度与层次的生理生化过程，尚不能以单一的机制解释。对于NAFLD的发病机制，现在比较认同的是“二次打击”学说［3－4］。细胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）是一类主要存在于肝脏和肠道的单加氧酶系，可参与脂肪酸类固醇激素等内源性底物的氧化和代谢、固醇类的生物合成以及大部分药物和外源物的生物氧化等，并催化多种内源性物质和外源性物质的代谢［5］。目前，针对NAFLD发病进程中CYP450酶的变化的研究尚且很少。该研究主要以NAFLD发展进程中各病理阶段的大鼠为研究载体，利用Western blot法探讨与临床药物代谢密切相关几种主要的CYP450酶的表达变化，旨在对NAFLD患者进行临床个体化用药，以提高疗效和减少不良反应。

2015－05－08接收

1　材料与方法

1．1材料

1．1．1实验动物

健康雄性SD大鼠60只，体重（210±20）g，由安徽医科大学实验动物中心提供，给予正常饮食，标准环境适养1周。

1．1．2主要试剂

谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和三酰甘油（triglyceride，TG）测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所；CYP1A2抗体、CYP2E1抗体、CYP2D6抗体和CYP3A1抗体购自北京博奥森科技有限公司；BCA测定试剂盒、ECL显影液购自上海碧云天生物技术研究所；山羊抗兔IgG及抗β-actin抗体购自美国Santa Cruz公司。

1．1．3主要仪器

全波长酶标仪（型号：uQuant，美国Biotek公司）、显影仪（型号：ChemiQ 4600，上海欧翔科学仪器有限公司）。

1．2方法

1．2．1实验动物分组与NAFLD模型制备

大鼠适养1周后，随机分为4组，每组15只。从第2周始处死一批大鼠（对照组），其后用自制的高脂乳剂［6］（17%蔗糖＋46%花生油＋17%胆固醇＋4%吐温80＋9%全脂奶粉＋4%丙二醇＋1%脱氧胆酸＋1%食盐）对大鼠每日进行灌胃（10 mg／kg），并分别在第9周、第13周、第17周处死一批大鼠（具体造模的时间通过前期预实验来确定）。

1．2．2病理学检查与重新分组

在上述时期分别断头处死一批大鼠，取肝脏组织并洗净，后置于含10%的甲醛溶液中固定，石蜡包埋，HE染色，显微镜下观察各期肝脏组织样本的病理学改变情况，并按照文献［7］中的评分标准进行分级评分，最后统计评分结果。根据评分结果，按照所获NAFLD模型的严重程度，重新分为4组（每组挑选8只），即正常组、轻度脂肪变性组、重度脂肪变性组、脂肪性肝炎组（后续实验均按照此分组进行）。

1．2．3肝组织匀浆中AST、ALT、TG水平的测定

分别取200 mg正常组、轻度脂肪变性组、重度脂肪变性组以及脂肪性肝炎组的大鼠肝组织，按1∶9的比例加入生理盐水，用手动匀浆器冰上进行匀浆，转移至离心机中，2 500 r／min离心10 min，取上清液，分别按照试剂盒操作方法进行测定。

1．2．4肝组织蛋白的提取

分别取100 mg各组大鼠样本的肝组织，加入裂解液1 ml与PMSF 10μl，剪碎匀浆后裂解30 min，4℃、12 000 r／min离心30 min，取上清液并根据BCA蛋白测定试剂盒上操作对蛋白进行定量。蛋白溶液与上样缓冲液按4∶1的比例，于100℃水浴煮沸10 min，冷却后于－80℃保存。

1．2．5Western blot法测定肝组织匀浆中CYP1A2、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A1蛋白的表达

蛋白样品和标准蛋白Marker一起进行SDS-PAGE电泳，后200 mA湿法转膜50 min，用5%的脱脂牛奶TBST溶液室温封闭3 h，用一抗（1∶800）于4℃孵育过夜，TBST洗膜，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（1∶10 000）于脱脂牛奶中室温孵育1 h，TBST溶液洗膜，用ECL显影剂进行显影，并分析显影结果。

1．3统计学处理

2　结果

2．1高脂肪乳剂诱导的大鼠肝脏组织的病理学结果

光镜下，对照组肝脏组织中肝小叶结构清晰，汇管区未出现异常（图1A）；自高脂肪乳剂灌胃后，模型组此后各周均出现不同程度的肝细胞脂肪变性，第9周时，组别中极大多数大鼠肝脏组织处于轻度脂肪变性（含脂滴范围比例约为5%～33%），伴随着少量的炎性细胞浸润（图1B）；第13周时，组别中大鼠肝组织光镜视野下都出现肝小叶结构紊乱，并伴随大量的大泡性脂肪空泡（含脂滴范围比例大于66%），炎症细胞浸润明显，属于重度脂肪变性时期（图1C）；第17周时，组别中大鼠大多数肝组织汇管区出现大量的炎细胞浸润，假小叶内相邻肝细胞干酪样坏死并膨胀突出，提示进入脂肪性肝炎时期（图1D）。根据最终染色结果与NAFLD诊断标准，每个时期中挑选合适数量、造模效果比较好的样本进行后续研究。

2.2肝组织匀浆中AST、ALT、TG水平

NAFLD的发展进程中，肝组织匀浆中AST、ALT的活性显著上升（F＝11．243、598．967，P＜0．01），ALT与AST的比值在进程中逐渐由小于1转变为大于1。而TG的水平在正常组和重度脂肪变性组这个进程区间中是明显上升的，但脂肪性肝炎组的数值比重度脂肪变性组明显下降（F＝80．313，P＜0．01），见表1。

表1　NAFLD不同时期肝组织匀浆中AST、ALT、TG的测定结果（n＝3，±s）

表1　NAFLD不同时期肝组织匀浆中AST、ALT、TG的测定结果（n＝3，±s）

与正常组比较：**P＜0．01；与重度脂肪变性组比较：＃＃P＜0．01

组别　AST（U／gprot）　ALT（U／gprot）　TG（mmol／gprot）34．11±2．88　31．57±1．26　0．132 8±0．016 0轻度脂肪变性　57．22±4．90　45．24±1．50　0．224 0±0．047 8重度脂肪变性　68．62±13．53　78．97±0．75　0．657 4±0．033 5脂肪性肝炎　70．44±1．02**　83．24±2．05**　0．363 2±0．032 4**＃＃正常

2.3肝组织匀浆中 CYP1A2、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A1的表达

NAFLD的发展进程中，CYP1A2、CYP2D6和CYP3A1总体呈下降趋势。其中脂肪性肝炎组与正常组比较，CYP1A2（F＝68．425，P＜0．01）和CYP2D6（F＝287．895，P＜0．01）的下降幅度非常明显，而CYP3A1的总体则呈略微下降（F＝12．098，P＜0．05），过程中仅重度脂肪变性组和轻度脂肪变性组比较有下降（F＝5．352，P＜0．05），其它病理时期过程中差异无统计学意义。CYP2E1在进程中持续呈上升趋势，其中轻度脂肪变性组和正常组比较（F＝11．307，P＜0．01），脂肪性肝炎组与重度脂肪变性组比较均显著上升（F＝53．454，P＜0．01）。见图2～5。

3　讨论

该实验通过利用高脂肪乳剂成功诱导了NAFLD发病进程中的4个时期模型。病理学结果显示，肝脏第9周出现轻度的脂肪变性，第13周出现重度的脂肪变性，第17周出现脂肪性肝炎。实验过程中，由于中度脂肪变性（含脂滴33%～66%）出现时间很短，很容易直接过渡到重度脂肪变性，组织样本获取仅2例，故实验中没有设置中度脂肪变性组。

NAFLD发病机制的“二次打击”学说中的“初次打击”即肝脏脂肪蓄积、胰岛素抵抗，其中胰岛素抵抗是脂质在肝脏内累积的开端。“二次打击”主要是氧化应激和脂质的过氧化反应。是由氧化应激所导致的脂质过氧化损伤以及其异常细胞因子的作用所导致的肝脏炎症与肝脏纤维化，并最终可能导致肝脏坏死。而氧化应激条件下线粒体产生的氧自由基则能以多种方式诱导肝脏损伤，主要通过与生物分子（如脂质、蛋白质、核酸等）的相互作用，从而改变其结构并且影响功能。

在NAFLD的发病期间，肝脏的代谢功能受到很大的影响，与代谢密切相关的肝药酶可能会发生改变，但肝药酶具体如何改变的报道目前并不多。CYP1A2主要参与华法林、茶碱、美西律、硝苯地平、非那西丁等多种药物的代谢过程，同时在一些前毒性物质和前致癌物的体内活化过程中也起重要作用［8］；经CYP2D6代谢的药物占总P450代谢药物的30%，主要参与抗精神病、抗心律失常、抗抑郁症等多种临床常用药物的代谢，是最具有遗传多态性的酶系，与许多药物代谢和疾病的易感性有关［9］；CYP2E1可介导多种化合物所致的肝损伤效应，如乙醇、氯仿、对乙酰氨基酚等，被认为是机体对环境和毒物或致癌物敏感程度重要的决定因素［10］；CYP3A4是人肝脏中CYP450酶系中最重要的成分，约占30%～40%，在许多内源性和外源性化合物的代谢中起着重要作用，参与了尼莫地平、环孢菌素、利多卡因等150多种药物的代谢，大鼠CYP450酶系中没有CYP3A4亚型，与之功能相对应的是CYP3A1／3A2［11］。

本研究表明，在NAFLD的发病进程中，CYP1A2 和CYP2D6下降幅度非常明显，CYP3A1的下降幅度却微乎其微，CYP2E1则是呈上升趋势。以往的报道［12］表明，CYP1A2在肿瘤坏死因子α和白介素1β炎症细胞因子的存在下会明显下降，而NAFLD的发病机制与炎症的增多有关，这可能是CYP1A2蛋白表达显著下降的原因。研究［13］显示，CYP2D6和众多亚型如CYP1A2、CYP3A4的活性均呈现下降的趋势，本实验结果与之相符。CYP2E1是针对脂肪肝研究较多的P450亚型之一，研究［14－15］表明CYP2E1表达水平的明显升高与脂质过氧化水平显著升高密切相关，在脂肪肝状态下，胰岛素抵抗加强，肝脏蓄积过多的脂肪，使酮体增加而导致高酮体血症，从而会诱导CYP2E1的表达增加。CYP2E1在电子的传递过程中，很容易出现偶联，产生氧自由基进而引起细胞损伤。

近年来在许多有关CYP450酶系与NAFLD之间关系的研究中，不同的CYP450酶系在NAFLD不同病理阶段所发挥的作用各有不同。如若对于P450酶系各亚型的作用机制做出深入的探究，那么针对NAFLD不同阶段的治疗即可真正从分子水平入手，临床可以根据肝药酶的活性适当增加或减少给药剂量，或给予适当的激动剂或抑制剂来调节酶的活性，从而达到最佳治疗效果并避免不必要的毒性。

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中图分类号R 966；R 575．5

文献标志码A

文章编号1000－1492（2015）10－1385－05

基金项目：安徽省高等学校省级自然科学研究重点项目（编号：KJ2013A153）

作者单位：安徽医科大学药学院，合肥230032

作者简介：余庆，男，硕士研究生；金涌，男，教授，硕士生导师，责任作者，E-mail：aydyjs＠163．com

Analysis of hepatic cytochrom e P450 enzymes in rats with progressive stages of non-alcoholic fatty liver disease

Yu Qing，Xu Man，Zhao Qianru，et al
（School of Pharmacy，AnhuiMedical University，Hefei230032）

AbstractObjectiveTo study the alterations of cytochrome P450 enzymes in rats liver with progressive stages of non-alcoholic fatty liver disease（NAFLD）．MethodsNAFLD models were established．Activities of hepatic aspartate aminotransferase（AST），alanine aminotransferase（ALT）and levels of triglyceride（TG）were measured by assay kit．The CYP1A2，CYP2D6，CYP2E1 and CYP3A1 protein expressions were detected byWestern blot analysis．Resu ltsHigher activities of ALT and AST were detected（P＜0．01）as the severity of NAFLD increased．TG levels increased remarkably in the range from normal to serious steatosis，and then decreased dramatically．Protein expressions of CYP1A2，CYP2D6 and CYP3A1 tended to decrease with NAFLD progression while CYP2E1 was increased consecutively．ConclusionThese results suggest that significant and novel changes occur in hepatic P450 expression during progressive stages of NAFLD．Itmay provide a valuable framework for physicianswhen determining the pharmacotherapeutic options and dosing regimens to patients with this disease．

Key wordsnon-alcoholic fatty liver disease；cytochrome P450 enzyme；liver homogenate；protein expression