周　鹏，丁莹莹，林子玉，冯娇娇，高彩霞，王锦红，杨　华，温宗梅，潘　卫，邓松华，3

结核分枝杆菌特异性蛋白片段Rv3388和6种特异抗原在结核抗体检测中的应用价值

周鹏1，丁莹莹2，林子玉1，冯娇娇2，高彩霞2，王锦红2，杨华1，温宗梅1，潘卫2，邓松华1，3

摘要目的对结核分枝杆菌（MTB）PE家族的所有成员的结构进行分析，预测其抗原表位，截取Rv3388蛋白的优势抗原片段，对重组Rv3388蛋白及其它6种MTB特异性抗原进行评估，探讨不同结核特异性抗原与血清抗体的反应模式，评价血清学检测在结核病诊断中的价值。方法利用基因合成技术重叠延伸PCR扩增Rv3388蛋白637～731位的编码基因片段，原核表达并纯化重组蛋白pET32a／Rv3388637-731，将纯化的重组蛋白免疫BALB／c小鼠，采用间接ELISA法对该抗血清进行免疫原性分析。同时对这7种MTB特异性蛋白的特异性及敏感性进行评价。结果重组蛋白pET32a／Rv3388637-731在大肠杆菌中的表达量占全菌蛋白的80%，ELISA显示有较强的免疫原性。7种MTB特异性抗原具有不同的反应模式，单个抗原检测敏感性较差。结论对MTB PE家族的蛋白结构分析，表达并纯化重组蛋白pET32a／Rv3388637-731，7种蛋白在血清抗体检测中具有抗原互补性，不同抗原与机体反应存在不同反应模式，提高结核抗体检测敏感性应多种抗原联合检测。

关键词结核分枝杆菌；Rv3388；ELISA；特异性；敏感性

结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis，MTB）俗称结核杆菌，是引起结核病的致病菌，目前仍然是一种高死亡率的慢性传染性疾病。2011年统计数据［1］显示全球新发结核病患者达900万之多，约有140万人死于结核病。目前常用的肺结核诊断技术如痰涂片、结核菌培养都很难满足临床需要，早期、快速、精确诊断结核病是一个难点，也是一个热门课题。1998年MTB全基因组测序工作完成［2］，通过对MTB蛋白质组学的研究［3］，各种MTB特异性蛋白抗原不断被研究发现，为结核抗体的检测奠定了良好的基础。在血清抗体检测中，ELISA法以其简单、快速、灵敏等优点在临床检验方面被推广应用［4］。该研究旨在通过分析MTB家族蛋白结构特性，预测其优势抗原表位，表达其具有抗原表位的片段，评价与其它6种MTB特异性蛋白（16KD、38KD、ESAF-6、CFP-10、MPT64、11488）作为血清学检测靶标的应用价值，探讨其反应模式。

1　材料与方法

1．1材料

1．1．1血清与蛋白来源80例结核病患者血清来自上海市肺科医院，96例健康者血清来自第二军医大学附属长海医院血液科。16KD、38KD、ESAF-6、CFP-10、MPT64，11488蛋白来自上海市肺科医院。

1．1．2载体和菌株宿主菌大肠杆菌（E．coli）TOP10，E．coli BL21（DE3）及其原核表达载体pET32a均由第二军医大学病原生物学教研室保存。pMD-18T载体（T载体）购自日本TaKaRa公司。

1．1．3酶与主要试剂Taq DNA聚合酶购自上海申能博彩公司羊抗人IgG-HRP和羊抗鼠IgG-HRP购自上海华美生物公司；质粒抽提试剂盒、DNA凝胶回收纯化试剂盒均购自上海生工生物有限公司；限制性内切酶EcoR I和Sal I、DNA分子量Marker DL 2 000、TA克隆试剂盒均购自日本TaKaRa公司；高效连接液（ligation high，LH）购自日本TOYOBO公司。

1．2方法

1．2．1生物信息学分析利用DNASTAR（7．1．0）软件对MTB PE家族99个成员的氨基酸结构进行分析，显示其家族氨基酸序列富含了大量GGXGG序列，本研究选取了其中一个家族成员 Rv3388进行分析，截取了亲水性高的以GGNGG为主的一段序列进行全基因合成。序列如下：VGATGGNGGSGI GPASVGGNGGKGGVGAAGGLAGQIGNGGSGGSGGAGGNGGTGDTAGNGGNGGAGAVGGNAQLIGNGGNG-

2015－06－02接收

2第二军医大学病原生物学教研室，上海2004333安庆医药高等专科学校，安庆246052

1．2．2引物设计与合成

1．2．2．1全基因体外合成引物序列

根据Gene-Bank（GeneBank：YP＿177968．1 GI：57117101）中MTB标准株序列以及大肠杆菌的偏好密码子设计并且合成了4对重叠互补引物，用以重叠延伸（over-lap extension，OE-PCR）体外合成Rv3388637-731序列。上游引物分别命名为U1、U2、U3、U4；下游引物分别命名为D1、D2、D3、D4；每条引物长约51 bp，引物之间相互重叠区域包含18个互补碱基，全基因序列全长282 bp［5］。

1．2．2．2表达载体构建用引物设计

将Rv3388637-731序列经大肠杆菌密码子优化后，设计一对用于PCR扩增目的序列的上下游引物，同时分别在上游引物（F1）增加了EcoR I的酶切位点（GAATTC）和6个酶切位点保护碱基。下游引物（R1）在末端增加Sal I的酶切位点（GTCGAC）和6个酶切位点保护碱基。以上所有引物采用DNAMAN V6软件进行分析和评价，由上海杰李生物有限公司合成。具体引物序列见表1。

表1　全基因合成　Rv3388637-731和扩增编码　DNA的引物序列

1．2．3Rv3388637-731DNA的全基因合成，克隆及序列测定

采用设计合成的4对重叠互补引物，利用OE-PCR的方法，分三轮体外合成编码Rv3388637-731的序列。第一轮PCR反应体系，总反应体积25μl包括：每对互补重叠引物，U1／D1，U2／D2，U3／D3，U4／D4，引物浓度为20μmol／L，Taq DNA聚合酶以及对应反应Buffer。OE-PCR反应条件：94℃预变性10 min，94℃变性30 s，60℃退火35 s，72℃延伸30 s，总共35个循环，72℃延伸10 min；第一轮反应产物分别命名为U1D1、U2D2、U3D3、U4D4。第二轮PCR以第一轮产物两两为模板，采用片段头尾核酸为引物，如以U1D1和U2D2为模板，以U1和D2作为上下游引物扩增片段U1D2，PCR程序和反应体系同第一轮，具体合成步骤见图1，将最后一轮PCR产物经DNA凝胶回收并纯化后克隆到pMD-18T载体中，按照试剂盒说明书进行操作。16 h后转化至大肠杆菌感受态细胞E．coli TOP10，转化后固体培养基上的单克隆（任意挑取10个）进行PCR鉴定及测序鉴定（由上海杰李生物有限公司进行序列测定，下同）。

1．2．4Rv3388637-731的扩增以及克隆

以上述测序正确的阳性质粒为模板，分别以F1／R1为上下游引物（引物浓度10μmol／L），PCR扩增Rv3388637-731目的序列，PCR反应条件同上。将DNA凝胶切胶回收纯化后的产物克隆至pMD-18T载体中。对转化后固体培养基上的单克隆（任意挑取10个）进行PCR鉴定及测序鉴定后，测定正确的质粒命名为pMD-18T-Rv3388637-731。

1．2．5Rv3388637-731原核表达载体的构建

分别以鉴定正确的pMD-18T-Rv3388637-731为模板，以F1和R1为上下游引物进行PCR扩增，反应体系条件均同前。PCR产物回收纯化后使用限制性内切酶EcoR I和Sal I进行双酶切，37℃作用3 h，DNA胶回收纯化酶切后产物。与此同时，原核表达质粒pET32a用同样方法进行双酶切，纯化回收酶切产物。将两种酶切产物在LH的作用下16℃连接反应16 h。将连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞E．coli TOP10，取200μl涂布于含Amp（100μg／ml）的2YT平板上。挑取平板上5个单克隆扩大培养，用S．Tag和T7ter两种通用引物行PCR鉴定，挑选鉴定正确的质粒进行DNA测序，将测序正确的质粒命名为pET32a／Rv3388637-731。

1．2．6pET32a／Rv3388637-731融合蛋白的诱导表达及纯化

选取测序正确的pET32a／Rv3388637-731重组阳性质粒转化至感受态细胞E．coli BL21（DE3）中，任意挑取固体培养基上3个单克隆培养过夜，次日分别转接50μl至3 m l2×YT培养液（Amp 100 mg／m l＋Kana 35 mg／ml）中，设置1管对照，4 h后每管3 μl加入IPTG（1 mmol／L）小量诱导表达（对照管不加），诱导4 h后收集细菌培养液1 ml，12 000 r／min离心1 min，弃去上清液，沉淀中加入100μl 2× SDS上样缓冲液，100℃煮沸10 min后12 000 r／min离心1 min，取上清液上样。收集未经IPTG诱导的菌液以相同的方法制成SDS样品。12%SDS-PAGE鉴定表达结果。经SDS-PAGE证实的阳性表达菌种用作大量诱导表达。取表达菌pET32a／Rv3388637-731／BL21，以1∶1 000转接于 50 ml LB培养液（Amp 100 g／ml＋Kana 35 g／ml），37℃、250 r／min过夜后，以1∶100转接于450 ml LB培养液，培养至吸光度（absorbance，A）值A600为0．6时，加IPTG至终浓度1 mmol／L，继续培养4 h后离心，弃上清液，菌体用PBS（pH＝7．2）溶解，超声破碎后12 000 r／min离心10 min，收集上清液与沉淀，上清液过Ni-NTA柱进行蛋白纯化，分别用10、20、100、300 mmol／L咪唑进行洗脱，分别收集洗脱液，进行SDSPAGE电泳检测。

1．2．7小鼠免疫及抗血清制备

选BALB／c小鼠5只，第1次免疫使用pET32a／Rv3388637-731蛋白样品（含量0．35～0．40 mg）与弗氏完全佐剂等体积混合，多点注射小鼠皮下及四肢，每只小鼠注射0．5 ml。2周后将蛋白样品（蛋白含量0．30 mg）与弗氏不完全佐剂等体积混合进行2次免疫。以后每隔2周免疫1次，方法及剂量均同第2次。4次免疫后，经眼球动脉大量取血，约1 ml／只，12 000 r／min离心10 min，取上层血清，－40℃冻存备用。

1．2．8pET32a／Rv3388637-731蛋白的免疫原性分析

采 用ELISA 法，将pET32a／Rv3388637-731，PEPTIDE／Rv3388637-731和pET32a3种蛋白分别用50 mmol／L碳酸盐缓冲液（pH＝9．6）包被于96孔酶联反应板上，100μl／孔，37℃孵育3 h，用10%脱脂奶粉于37℃（200μl／孔）封闭过夜后，每孔加入倍比稀释的免疫小鼠抗pET32a／Rv3388637-731血清（工作浓度1∶20），37℃孵育1 h，Tris-Tween洗板3次；加入羊抗鼠IgG-HRP（1∶2 000稀释）100μl／孔，37℃孵育l h，Tris-Tween漂洗5次后经四甲基联苯胺（TMB）显色后用酶标仪于450 nm波长处测定A450值，以高于空白对照A450值2倍的数值作为阳性判断标准，使用免疫前小鼠血清作为空白对照。

1．2．97种MTB特异性蛋白的血清学分析

为了分 析pET32a-Rv3388637-731、16KD、38KD、ESAF-6、CFP-10、MPT64、11488这7种蛋白在血清学检测中的特异性、敏感性以及各抗原的反应模式，将这7种蛋白及载体蛋白pET32a分别用50 mmol／L碳酸盐缓冲液（pH＝9．6）包被于96孔酶联反应板上，0．5 mg／孔，37℃孵育3 h，用10%脱脂奶粉于37℃（200μl／孔）封闭过夜后，Tris-Tween洗板4次；分别以健康者血清和结核患者血清为一抗（工作浓度1∶20），37℃孵育1 h，Tris-Tween洗板3次；以HRP标记的羊抗人IgG为二抗（工作浓度1∶2 000），37℃孵育1 h，Tris-Tween漂洗5次后经TMB显色后用酶标仪于450 nm波长处测定A450值。将每一份待检血清的A450值与临界值比较，以阴性血清的平均值＋2倍标准差为临界值，以A450值＞临界值作为阳性判断标准进行结果判定［6］。

1．3统计学处理

使用SPSS 17．0软件进行分析，敏感性（%）＝（真阳性）／（真阳性＋假阴性）× 100%，特异性（%）＝（真阴性）／（真阴性＋假阳性）×100%。

2　结果

2.1Rv3388637-731的体外全基因合成、克隆及序列测定

利用OE-PCR的方法，体外成功合成了Rv3388637-731基因序列，经过3轮PCR扩增出与理论值282 bp大小相符合的目的片段（图2），该目的片段切胶回收纯化后，产物克隆至pMD-18T载体中，挑取10个单克隆用通用引物RVM和M13-47进行序列测定，测序结果经 DNASTAR（7．1．0）软件分析，结果表明该合成的目的基因编码的氨基酸序列与MTB基因组中对应区段的氨基酸序列完全一致。

2.2Rv3388637-731原核表达载体的鉴定

将Rv3388637-731片段与pET32a原核表达载体连接，获得重组表达质粒，挑取5个单克隆，用S．Tag和T7ter两种通用引物PCR鉴定，1．5%琼脂糖凝胶电泳检测测序结果证明质粒构建正确。见图3。

2.3pET32a-Rv3388637-731的表达及纯化

将pET32a-Rv3388637-731重组质粒转化至宿主菌E．coli B121（DE3），用 IPTG小量诱导表达，12%SDSPAGE鉴定结果显示：与对照管（未诱导）条带比较，pET32a／Rv3388637-731诱导表达的条带中出现相对分子质量为28 ku的条带（图4），符合理论值。用Ni-NTA柱纯化pET32a／Rv3388637-731蛋白，经 12%SDSPAGE鉴定，纯化后pET32a／Rv3388637-731蛋白为相对分子量为28 ku的条带（图5），与理论值相符。

2.4pET32a／Rv3388637-731蛋白的免疫原性分析

ELISA分析表明，抗鼠pET32a／Rv3388637-731抗血清与pET32a／Rv3388637-731蛋白和PEPTIDE／Rv3388637-731蛋白均呈特异反应，其抗体滴度分别为1∶32 000和1∶16 000，与pET32a表达蛋白反应较弱（图6），说明该抗血清抗体主要是针对Rv3388637-731特异性片段。

2.5MTB 7种蛋白间接ELISA分析

以pET32a／Rv3388637-731、16KD、38KD、ESAF-6、CFP-10、MPT64、11488这7种蛋白为抗原分别检测80例结核患者血清以及96例正常者血清，测定A450值＞阴性血清的平均值＋2倍标准差作为阳性结果（表2）。

表2　单个抗原和多个抗原联合检测血清敏感性与特异性结果

3　讨论

目前结核病实验室诊断的金标准是细菌学检测，但检出率低，培养周期长，繁琐费时，不能用于快速诊断。血清学检测是一种快速简便的实验室诊断方法，本实验利用这种方法对7种MTB特异性抗原进行检测，显示不同类型的抗原在宿主体内表达的数量、种类各不相同，这是由于MTB抗原多而复杂，表现出不同的反应模式，单一抗原用于检测不能符合临床诊断要求。

1998年，MTB全基因组测序完成后，富含甘氨酸和丙氨酸的酸性蛋白质家族－PE家族首次被发现，因其N端都含有PE基序，因而得名［7］。RV3388编码的PE-PGRS52属于PE-PGRS蛋白亚家族，可能存在于MTB的菌膜及菌壁中，在MTB的抗原变异方面起主要作用［8－10］。本实验通过分析PE家族99个成员的蛋白结构，显示该家族富含大量以GGXGG基序的片段，但大部分以疏水性氨基酸组成，不利于原核表达，因此本实验选取了一段亲水性较高，以GGNGG为主的一段抗原表位集中区域，该片段能够覆盖整个PE-PGRS蛋白亚家族，原核表达此蛋白片段，纯化蛋白表达产物，间接ELISA显示有较高的免疫原性。以80例结核患者血清及96例正常者血清为样本，通过间接ELISA法检测该蛋白片段的抗原性，结果显示pET32a／Rv3388637-731的特异性为 97．9%，敏感性为37．5%；与16KD、38KD联合检测后，敏感性明显提高；这表明pET32a／Rv3388637-731作为单一抗原用于血清学检测意义不大，但可以作为结核联合诊断的备选抗原。

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中图分类号R 392．1

文献标志码A

文章编号1000－1492（2015）10－1404－06

基金项目：国家高技术研究发展计划（863计划）（编号：ss2014AA021403）；国家自然科学基金项目（编号：30872405，30472050，30972632）

作者单位：1安徽医科大学病理生理学教研室，合肥230032

作者简介：周鹏，男，硕士研究生；潘卫，男，教授，博士生导师，责任作者，E-mail：weipan＠yahoo．com；邓松华，男，教授，硕士生导师，责任作者，E-mail：desoh＠126．comGGGGNGGTGADGT。

Assessment of the detection effect of specific protein fragment of Rv3388 and six kinds of antigens in tuberculosis antibody response

Zhou Peng1，Ding Yingying2，Lin Ziyu1，et al
（1Dept of Pathophysiology，Anhui Medical University，Hefei230032；2Dept of Medical Microbiology and Parasitology，The Second Military Medical University，Shanghai200433）

AbstractObjectiveTo analyze the structure of allmembers in the PE family of Mycobacterium tuberculosis（MTB）and predict the antigen epitope，we chose the dominantantigen fragments of Rv3388 protein and estimate the antigenicity of notonly the recombinant Rv3388 protein but aslo the other six kinds of specific antigens of MTB．To investigate the reaction model between the different tuberculosis specific antigen and serum antibody，and to evaluate the value of serologicaldetection in the diagnosis of tuberculosis．MethodsThe gene coding637～731 amino acid fragment of Rv3388 was amplified by over-lap extension-PCR．The prokaryotic expressed and purified recombinant protein pET32a／Rv3388637-731 was utilized to immunize BALB／c mice，and the immunogenicity of the antiserum and the specificity and sensitivity of seven kinds specific proteins of MTB were analyzed by indirect ELISA．Results

The amount of recombinant protein pET32a／Rv3388637-731 expressed in E．coli was 80%of the total protein．The results of ELISA showed strong immunogenicity．The reaction patterns of antigenswere differentwith each other，and the detection sensitivity of single antigen was poorer．ConclusionThe structure of allmembers in the PE family ofMTB is analysed，and the recombinant protein pET32a／Rv3388637-731 is expressed and purified successfully．Seven kinds ofproteins in the serum antibody are antigen complementary in the detection．Differentantigen is different reaction pattern．A variety of antigens should be jointly detected to improve the sensitivity of antibody detection of tuberculosis．

Key wordsMycobacterium tuberculosis；Rv3388；ELISA；specificity；sensitivity