秦　宇，陈琼琼，翟志敏，夏瑞祥，周海胜

LMO4的异位表达对NB4细胞增殖和分化的影响

秦宇1，陈琼琼1，翟志敏2，夏瑞祥3，周海胜1

摘要目的探讨LMO4对急性早幼粒白血病细胞系NB4细胞增殖和分化的影响。方法利用qRT-PCR和Western blot法检测NB4中LMO4表达；利用慢病毒介导LMO4的cDNA感染NB4细胞后，建立过量表达LMO4的NB4细胞株；采用MTT法检测细胞增殖；使用全反式维甲酸（ATRA）诱导NB4细胞分化0～48 h，瑞氏染色观察分化的细胞特性；流式细胞术分析NB4细胞分化后产生CD11b阳性的细胞比例。结果qRT-PCR和Western blot结果均提示NB4 中LMO4表达增加；ATRA诱导NB4分化时，LMO4的表达降低；MTT结果证实过量表达LMO4促进NB4增殖；瑞氏染色和流式细胞术结果均显示，过量表达LMO4能够促进ATRA诱导NB4细胞分化。结论LMO4参与调节NB4细胞的增殖，并能增加NB4细胞对ATRA的敏感性，促进其分化。

关键词急性早幼粒细胞白血病；NB4；LMO4；全反式维甲酸

LMO4和LMO2同属LIM基因家族成员，通过其特有的LIM结构域与其它转录因子相互作用，调节基因的转录，参与调控细胞增殖和分化等［1］。研究［2］表明LMO2参与调控早期红系细胞的发育和分化；研究［3］显示定位于人11号染色体的LMO2发生易位突变t（11；14）（p13；q11），导致T淋巴细胞内LMO2基因的异位激活而异常表达，诱发T细胞型急性淋巴细胞白血病。而LMO4广泛表达于胚胎组织和成体组织［4］；在乳腺癌组织中LMO4表现为高表达［5］。但是，由于LMO2和LMO4结构上的高度同源性，因此两者都能与共同的转录因子LIM结构域结合蛋白1（LIM domain binding protein 1，LDB1）组成蛋白复合体共同调控目的基因表达［6］。LMO4蛋白可能存在类似LMO2蛋白的功能，参与造血细胞的发生、发育和分化。早在2006年Meier研究团队在对小鼠红系白血病细胞系MEL细胞的研究［7］中同时得到与LDB1结合的LMO2蛋白复合体和LMO4蛋白复合体；同时证实LMO4蛋白复合体参与了调控斑马鱼后期造血细胞发生。而有关LMO4对人造血细胞增殖和分化等方面的作用，目前鲜有报道。该研究选择急性早幼粒白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）细胞系NB4作为研究对象，研究LMO4在其分化过程中表达规律以及LMO4的过量表达对NB4细胞增殖和分化的影响。

1　材料与方法

1．1细胞株和载体

NB4细胞由上海交通大学陈字博士惠赠。含人LMO4基因cDNA表达框的慢病毒表达载体GV287-LMO4购自上海吉凯基因公司。

1．2试剂

RPMI-1640细胞培养基、100×青霉素链霉素双抗混合液、PBS均购自美国Hyclone公司；胎牛血清购自美国Gibco公司；Taq酶、逆转录试剂盒、PCR试剂盒、SYBR荧光定量试剂盒、DNA Marker购自日本TaKaRa公司；TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司；兔源抗体LMO4单克隆抗体；β-actin单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；PE标记CD11b抗体购自美国BD公司；HRP标记的IgG羊抗鼠、羊抗兔二抗购自北京中杉金桥公司；全反式维甲酸（all trans retinoic acid，ATRA）购自美国Sigma公司；氯化硝基四氮唑蓝（nitrotetrazolium blue chloride，NBT）、佛波醋酸酯（tetradecanoylphorbol acetate，TPA）、SDS-PAGE凝胶试剂盒购自上海碧云天公司；Annexin V-APC／PI试剂盒购自美国eBioscience公司。

1．3方法

1．3．1引物设计

根据NCBI数据库查询基因组序列，使用在线Primer-BLAST引物设计软件设计检测用引物，内参基因 β-actin（Genbank号：NM＿001101）上游引物：5′-TGGACATCCGCAAAGAC-3′，下游引物：5′-AAGGGTGTAACGCAACTAA-3′，PCR产物为302 bp；LMO4（Genbank号：NM＿006769．3）上游引物：5′-CGGACCGCTTTCTGCTCTAT-3′，下游引物：5′-CACTCGCAGGAATCGACTGT-3′，PCR产物

2015－06－02接收

1．3．2细胞培养NB4细胞系用含10%胎牛血清的RPMI-1640细胞培养基于5%CO2、37℃培养。为体外诱导NB4细胞分化，培养基中加入1μmol／L ATRA分别作用0、24、48、72 h，收集细胞，提取总蛋白，进行Western blot分析。

1．3．3建立稳定过表达LMO4的NB4细胞株

利用含有人LMO4基因cDNA表达框的慢病毒表达载体GV287-LMO4，按照常规包装病毒，载体自带绿色荧光蛋白基因。病毒采用复感染指数（multiplicity of infection，MOI）值为10的条件感染NB4细胞，72 h后观察绿色荧光强度，获得稳定细胞克隆，扩大培养并保存细胞。设置实验分组：正常NB4细胞为对照组；转入LMO4基因的NB4细胞为实验组。

1．3．4qRT-PCR法检测

根据参考文献［8］操作如下：根据TRIzol Reagent说明书提取细胞的总RNA，按照逆转录酶说明书操作进行逆转录，获得cDNA，以此为模板进行PCR。PCR反应条件为：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸60 s，32个循环，最后72℃继续延伸7 min，反应终止。PCR产物经1．0%琼脂糖凝胶电泳检测。按照SYBRⓇPremix Ex TaqTM试剂盒说明书进行qRTPCR检测，实验重复3次。

1．3．5Western blot法检测

根据参考文献［9］，收集细胞，加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，冰上裂解30 min，100℃水浴煮沸10 min使蛋白变性。Bradford法分析蛋白浓度，10%SDS-PAGE中分离蛋白，恒流200 mA、1．5 h将蛋白湿转到PVDF膜上。5%脱脂奶粉的TBST封闭40 min，孵育一抗兔抗LMO4抗体（1∶2 000稀释）、鼠抗β-actin抗体（1 ∶3 000稀释），4℃过夜，次日1%TBST洗膜，室温孵育二抗（1∶5 000稀释）6 h，洗膜，增强化学发光法X线片曝光显影。

1．3．6MTT法检测

取对数生长期的细胞，制备细胞悬液，调整细胞浓度为2．5×104／m l；每孔加入100μl细胞悬液，分别培养12、24、48、72 h；每孔加入10μl MTT溶液（5 mg／ml），于37℃继续孵育4 h；每孔加入100μl的甲臜（Formanzan）溶解液，在培养箱内继续孵育，直至在普通光学显微镜下观察发现甲臜蓝紫色结晶全部溶解，用酶标仪在490 nm测定光密度（optical density，OD）值，计算两种细胞间增殖是否有差异，并作图。

1．3．7NBT还原实验检测细胞分化

将细胞按照1×105／ml接种到6孔板，每孔加入ATRA（终浓度为1μmol／L），诱导分化NB4细胞，分别在12、24、48 h收集细胞，计数。取500μl细胞悬液加入12孔板，加0．5 ml NBT反应液（0．2%NBT、100μg／ml TPA），37℃培养30min，拍照。计数200个细胞，重复5次，计算NBT阳性率。NBT阳性率（%）＝（NBT阳性细胞数／细胞总数）×100%。

1．3．8流式细胞术检测分化

将对数期细胞接种于6孔板，加入1μmol／L ATRA诱导分化；分别收集0、12、24、48 h的细胞，1 000 r／min离心5 min；PBS洗涤1次，100μl PBS重悬细胞后加入PE标记的CD11b抗体10μl，4℃避光孵育30 min；PBS洗涤1次，加400μl PBS重悬细胞，进行流式细胞术分析。

1．4统计学处理

2　结果

2.1NB4细胞分化过程中LMO4表达

结果显示LMO4在未分化的早幼粒细胞中具有较高的表达；经过ATRA诱导后，NB4细胞中LMO4的表达降低，与0 h比较，差异有统计学意义（t＝10．579、7．594、5．226，P＜0．01），见图1。

2.2过量表达LMO4的NB4细胞株的建立

为了进一步研究LMO4对NB4细胞增殖和分化的影响，拟建立稳定过量表达LMO4的NB4细胞株（NB4／LMO4）。选用含有人LMO4基因cDNA的慢病毒感染NB4细胞。感染48～72 h后，荧光显微镜观察绿色荧光，细胞阳性率在90%以上（图2）。收集对数生长期的NB4和NB4／LMO4细胞，分别提取总RNA和蛋白。利用总RNA进行qRT-PCR分析，结果显示过量表达LMO4的NB4／LMO4细胞中LMO4基因的mRNA水平较对照NB4细胞明显增高，差异有统计学意义（t＝21．92，P＜0．01），见图3；Western blot显示NB4／LMO4细胞株中LMO4蛋白比正常NB4细胞明显增高，见图4。已成功构建过量表达LMO4的NB4细胞株。

2.3过量表达LMO4对NB4细胞增殖的影响

采用MTT法检测LMO4过量表达对NB4细胞增殖的影响。接种NB4细胞和NB4／LMO4细胞，分别测定12～72 h的OD490值。与对照组NB4细胞比较，增殖24 h时过量表达LMO4的NB4细胞增殖速度明显增加，差异有统计学意义（t＝3．124，P＜0．05），48 h和72 h时，两者的增殖速度差异有统计学意义（t＝10．562、6．495，P＜0．01），见图5。过量表达LMO4促进NB4细胞增殖。

2.4过量表达LMO4对ATRA诱导NB4细胞分化的影响

NB4细胞在ATRA诱导下分化为成熟的粒细胞，其特异性标记分子CD11b高表达；且在NBT还原实验中细胞内可见蓝黑色颗粒。选择NB4细胞和NB4／LMO4细胞，利用ATRA分别诱导12、24、48 h，结果显示NB4／LMO4细胞显示蓝黑色的阳性率分别为7．8%、15．1%、21．3%，而对照组NB4细胞的分化阳性率分别为1．3%、6．3%、15．2%，两者比较差异有统计学意义（t＝5．719、6．361、3．555，P＜0．01），见图6、7；为进一步证实LMO4的过量表达对NB4细胞分化的影响，利用流式细胞术分析成熟粒细胞的标记分子CD11b＋细胞的比例。结果显示，诱导分化12、24、48 h，过量表达LMO4的NB4细胞中，CD11b＋细胞分别为11．9%、32．4%、66．0%；而对照组NB4细胞中CD11b＋细胞分别为 3．45%、15．3%、43．7%（图8）。可见CD11b＋细胞随着诱导时间增加而增加，过量表达LMO4时，有利于促进NB4的分化。

3　讨论

APL是急性髓细胞白血病的M3亚型，大多数APL患者是由于t（15；17）染色体发生移位导致维A酸受体（RARα）与早幼粒细胞白血病基因（promyelocytic leukemia，PML）形成PML-RARα融合基因，进而编码PML-RARα融合蛋白。这种融合蛋白通过显性负抑制作用抑制早幼粒细胞分化成熟并促进细胞增殖，其主要特点是骨髓和外周血中有大量未分化成熟的早幼粒白血病细胞［10］。目前临床多采用ATRA和三氧化二砷联合治疗APL，前者作用机制是诱导早幼粒细胞分化成熟；后者主要作用机制是诱导白血病细胞凋亡［11］。NB4细胞是早期从APL患者分离出来的永生化的细胞系，在体外可以通过ATRA诱导其分化变成成熟粒细胞，表现为NBT还原实验显示阳性、CD11b＋等特点；同时在体外使用三氧化二砷可以诱导其发生凋亡。因此，NB4细胞常常作为研究造血细胞分化和增殖的细胞模型［12］。

人LMO4基因定位于1号染色体，其编码产物LMO4蛋白是一种调控上皮细胞分化和增殖的重要转录因子，与LMO2蛋白具有高度同源性，都具有2个串联LIM结构域，在细胞核内同样发挥桥分子的作用，通过以LDB1蛋白为核心组成的蛋白复合体，结合协同调节不同转录因子的活性，在造血细胞分化过程中发挥了重要作用［13］。Meier et al［7］在小鼠白血病细胞系中已经证实了LDB1与LMO4结合形成一种大蛋白复合体，同时结合了LMO2、细胞周期蛋白依赖性激酶9（cyclin-dependent protein kinase 9，CDK9）等多种转录因子。这种大蛋白复合体存在于未分化状态细胞并维持细胞的增殖；当细胞发生分化时，大蛋白复合体发生解聚失去CDK9而形成LDB1-LMO2-LMO4为核心的小蛋白复合体，调控细胞分化。研究［8］证实在成血管细胞中过量表达LMO2，促进成血管细胞增殖，同时在诱导分化时也促进造血细胞分化，特别是有利于红系细胞的分化；而对于粒系、髓系和单核系血细胞形成作用不明显。

本研究显示LMO4在早幼粒细胞中高表达；利用ATRA诱导NB4细胞分化后，LMO4表达降低，提示LMO4参与调节NB4的增殖；在分化过程中LMO4具有负调控作用。通过建立过量表达 LMO4 的NB4细胞株并进行MTT实验，结果证实，与对照组NB4细胞比较，过量表达LMO4，促进NB4的增殖。利用ATRA诱导分化NB4细胞，NBT还原实验结果显示过量表达LMO4时，蓝黑色细胞比例较对照组细胞明显增加；流式细胞分析同时也证实过量表达LMO4的NB4在诱导分化后产生CD11b＋细胞的比例较对照组明显增高。因此，异位过量表达LMO4，可能在诱导分化时，导致大蛋白复合体的解离形成小蛋白复合体，从而增加了NB4细胞对ATRA的敏感性，有利于NB4细胞的分化。尽管临床同时使用三氧化二砷治疗APL，以促进白血病细胞的凋亡，但与对照组NB4细胞比较，过量表达 LMO4时，三氧化二砷诱导细胞凋亡的作用没有明显变化（结果未示）。因此，LMO4在NB4细胞高表达可能导致APL的白血病细胞过度增殖；同时也可能是临床使用ATRA治疗APL而增加白血病细胞对ATRA敏感性，有利于未成熟的原始幼稚粒细胞分化和成熟，其调控的分子机制有待进一步研究。

参考文献

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中图分类号R 34；R 733．71

文献标志码A

文章编号1000－1492（2015）10－1394－06

基金项目：国家自然科学基金（编号：81172591）

作者单位：1安徽医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室，合肥2300322安徽医科大学第二附属医院血液科，合肥2306013安徽医科大学第一附属医院血液内，合肥230022

作者简介：秦宇，男，硕士研究生；周海胜，男，副教授，硕士生导师，责任作者，E-mail：haishengs＠ahmu．edu．cn为201 bp。引物由上海生工生物公司合成。

Ectopic expression of LMO4 regulates NB4 cells proliferation and differentiation

Qin Yu1，Chen Qiongqiong1，Zhai Zhimin2，et al
（1Dept of Biochemistry and Molecular Biology，School of Basic Medicine，AnhuiMedical University，Hefei230032；2Dept of Hematology，The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei230601）

AbstractObjectiveTo investigate potiential functions of LMO4 in regulating proliferation and differentiation of acute promyelocytic leukemia cells（NB4）．MethodsThe expression of LMO4 in the acute promyelocytic leukemia cell line（NB4）was detected using qRT-PCR and Western blot，respectively．Depending on lentivirus transduction，NB4 cellswith overexpression of LMO4 were established．The MTT assay was performed to detect proliferation；NB4 cells were induced by all trans retinoic acid（ATRA）to differentiate into mature granulocytes，which could be detected by using NBT testor flow cytometry for analysis of CD11b＋cells．ResultsWestern blotanalysis showed that LMO4 ectopically expressed in NB4 cells，and expression level of LMO4 decreased during differentiation induced by ATRA．After transduced by lentivirus containing human LMO4 cDNA，the NB4 cell line with LMO4 overexpression was obtained according to detection of LMO4 expression using qRT-PCR and Western blot analysis．Compared to the control cells，the MTT assay showed LMO4 overexpression in NB4 cell could improve cells proliferation；meanwhile，both NBT tests and flow cytometry analysis indicated that LMO4 overexpression could also increase NB4 differentiation efficiency depending on ATRA induction．ConclusionEctopic expression of LMO4 in NB4 cells promotes cell proliferation，and increases differentiation potency of NB4 cells due to being available of sensitiveness to ATRA．

Key wordsacute promyelocytic leukemia；NB4；LMO4；ATRA