谷牧人,李骏白,张筱骅,殷咏梅

(1.温州医科大学定理临床学院温州市中心医院 肿瘤内科，浙江 温州 325000；2.温州医科大学附属第一医院肿瘤外科，浙江 温州 325000；3.南京医科大学，江苏 南京 210029)



苦参碱对人乳腺癌MCF-7细胞的促凋亡作用及其对线粒体跨膜电位的影响分析

谷牧人1,李骏白1,张筱骅2Δ,殷咏梅3

(1.温州医科大学定理临床学院温州市中心医院 肿瘤内科，浙江 温州 325000；2.温州医科大学附属第一医院肿瘤外科，浙江 温州 325000；3.南京医科大学，江苏 南京 210029)

目的 研究苦参碱对人乳腺癌(michigan cancer foundation-7，MCF-7)细胞的促凋亡作用及对线粒体跨膜电位的影响。方法 体外培养人乳腺癌MCF-7细胞，观察组细胞中加入不同浓度的苦参碱溶液，对照组细胞中加入等量的培养液。MCF-7细胞的凋亡与细胞线粒体跨膜电位采用流式细胞仪检测，MCF-7细胞的抑制率采用MTT的方法检测。结果 苦参碱处理24h后观察组的MCF-7细胞凋亡率明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，且随着浓度的升高而升高；苦参碱对于MGF-7细胞抑制率的结果显示，随着时间与浓度的增加苦参碱对于MGF-7细胞抑制率效应也随之增强，且差异有统计学意义(P<0.05)；苦参碱处理24 h后的罗丹明染色阳性数低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，表明线粒体跨膜电位与浓度呈负相关。结论 苦参碱对人乳腺癌MCF-7细胞有促凋亡的作用，其促凋亡的作用可能是通过降低线粒体跨膜电位而使MMP的通道打开。

苦参碱；乳腺癌；线粒体跨膜电位

近年来乳腺癌的发病率呈上升趋势，严重影响了女性的健康和生存质量。目前，治疗方法多采用药物化疗，其化疗制剂毒副作用大，费用昂贵，许多患者因此无法有效治疗而丧失了生存的机会。由于传统的中药具有毒副作用小、疗效好和价廉等优点，逐渐受到人们的关注。苦参碱(matrine，MAT)是从苦豆子、苦参等豆科植物中提取得到一种生物活性碱，研究发现，其在肺癌、肝癌、大肠癌、胃癌等的癌细胞中起到了促凋亡与抑制的作用[1-2]。本文旨在通过研究苦参碱对人乳腺癌MCF-7细胞的促凋亡作用及对线粒体跨膜电位的影响，初步探讨苦参碱抗乳腺癌的可能机制。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 苦参碱购自西安融升生物科技有限公司；乳腺癌MCF-7细胞株由温州医科大学定理临床学院温州市中心医院的细胞实验室来提供；RPMI-1640培养液购自南京医药股份有限公司；罗丹明染色试剂盒购自江苏恒瑞医药股份有限公司；新生胎牛血清购自四川科伦实业集团有限公司；胰酶与四甲基噻唑蓝MTT购自中美上海施贵宝制药有限公司。

1.2 仪器 SW-GJ-2FD型的超净工作台购自浙江大学医学仪器有限公司；3319型CO2培养箱购自Forma公司；BDFACS-Aria流式细胞仪购自双鸽集团有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养以及传代：将乳腺癌MCF-7细胞株从液氮罐中快速的取出放入37 ℃～42 ℃左右的水浴箱中进行解冻，待融化后把冻存管置于1500 r/min的离心机进行离心，将离心过的冻存管放在超净台内拿掉冻存液之后往里加入事先准备好的RPMI-1640培养液2 mL，用吸管轻轻的吹打悬浮着的细胞之后转移到培养瓶内，培养瓶内的培养液添加到4～5 mL，放入温度为37 ℃，CO2浓度为5%的培养箱内培养。细胞经过24 h的培养之后，通过倒置的显微镜观察培养细胞的生长状况，当细胞数量达到瓶底的80%左右时进行细胞的传代培养，把培养液换成约2 mL左右的消化液进行消化，继续通过倒置的显微镜观察，当细胞出现收缩细胞间有裂隙产生，还未变圆前，停止消化，把消化液换成新鲜的培养液，再轻轻的吹打贴在瓶壁上的细胞，使其全部悬浮后，在平均分开放入培养瓶内继续在温度为37 ℃，CO2浓度为5%的培养箱内培养。

1.2.2 细胞凋亡情况的检测：分别取观察组与对照组的细胞，弃去培养液，用胰酶进行消化，加入首先预冷的PBS进行洗涤，轻轻的吹打贴在瓶壁上的细胞使其悬浮。收集培养细胞在1500 r/min的尖底离心管内进行7 min的离心。把细胞数调整为1×105个/mL，采用相同的方法进行2次PBS洗涤，2次离心前都先把细胞放到流式测定管内，离心之后在流式测定管里加入100 μL的结合缓冲液来使细胞悬浮，在分别加入5 μL的Annexin V/FITC与10 μL的碘化丙啶溶液，混和均匀后在室温避光培养15 min，再加入400 μL的结合缓冲液及时用流式细胞仪进行分析。

1.2.3 苦参碱对于MCF-7细胞生长的抑制率：取处于对数期的乳腺癌MCF-7细胞，采用浓度为0.25%的胰酶消化和培养液轻轻的吹打悬浮的细胞，把浓度调整为2×104个/mL，接种于96个孔板内每个孔100 μL，再培养24 h，对细胞贴壁进行观察待生长良好之后，分别加入苦参碱溶液100 μL使其浓度为0.25、0.5、1.0、2.0 mg/mL，为观察组，另外对照组加入等量的培养液，各自设置4个复孔。温度为37 ℃，CO2浓度为5%的培养箱内培养。在苦参碱对其作用24、46、72 h之后MTT检测，检测前在每个孔内加入100 μL的DMSO，轻轻的振荡，10～15 min后，用酶标仪进行吸光度的测定。测量波长选择492 nm。计算出各个时间段观察组以及观察组的4个复孔内的平均吸光度的值。计算公式为：肿瘤细胞的生长抑制率=(1-观察组的吸光度/对照组的吸光度)×100%。

1.2.4 线粒体跨膜电位检测：选择5瓶对数期生长的MCF-7细胞，其中选取4瓶各自加入4 mL苦参碱溶液(含有培养液)，苦参碱的浓度为0.25、0.5、1.0、2.0 mg/mL作为观察组，取1瓶作为对照组加入等量的培养液。在温度为37 ℃，CO2浓度为5%的培养箱内培养24 h。药物对其作用24 h之后细胞采用0.25%的胰酶消化后再放置在培养液中，取细胞数1×106个/mL，然后添加10 μg/mL 罗丹明123染液在温度为37 ℃，CO2浓度为5%的培养箱内培养20 min离心，细胞用培养液清洗2次，然后用上流式细胞仪进行检测。

2 结果

2.1 苦参碱处理24 h后细胞凋亡率的比较 对照组MCF-7细胞凋亡率为(1.12±0.06)%；观察组中，浓度为0.25、0.5、1.0、2.0 mg/mL的苦参碱处理的细胞凋亡率分别为(4.27±0.26)%、(6.59±0.17)%、(16.16±0.23)%和(20.16±0.16)%。苦参碱处理24h后观察组的MCF-7细胞凋亡率明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，且随着浓度的升高而升高。见表1。

表1 苦参碱处理24 h后细胞凋亡率的比较Tab.1 Comparison of cell apoptosis rate by matrine after ±s,n=5)

*P<0.05，与对照组相比，compared with control group

2.2 MGF-7细胞抑制率的比较 苦参碱对于MGF-7细胞抑制率的结果显示，随着时间与浓度的增加苦参碱对于MGF-7细胞抑制率效应也随之增强，且存在统计学意义(P<0.05)；具体数据见表2。

表2 MGF-7 细胞抑制率的比较Tab.2 Comparison of cell inhibition rate for ±s,n=5)

2.3 苦参碱处理24 h后线粒体膜电位的比较 苦参碱处理24 h后的罗丹明染色阳性数低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，且罗丹明染色阳性数随着浓度的增升高而降低，呈负相关。见表3。

表3 苦参碱处理24 h后线粒体膜电位的比较±s,n=5)Tab.3 Comparison of mitochondrial transmembrane potential by ±s,n=5)

*P<0.05，与对照组相比，compared with control group

3 讨论

苦参碱是多种中草药的有效成分[3-4]。有研究表明，其具有很重要生物学活性，主要表现为抗病毒、抗癌、抗纤维化以及免疫调节等，具有上述多种药理生理作用，并通过体外实验显示苦参碱能够对多种癌细胞具有抑制生长或者广泛杀伤的作用[5-7]。罗丹明123能够透过细胞细胞膜，是一种阳离子的荧光染料，同时也是线粒体的跨膜电位指示剂。罗丹明123在正常的细胞中可以依赖线粒体的跨膜电位从而进入细胞的线粒体基质内，在进入的过程中其荧光的强度逐渐减弱直至消失，而在其发生凋亡时，细胞的线粒体膜的完整性受到破坏，使管理线粒体的膜通透性转运孔打开，从而引起细胞内线粒体的跨膜电位发生崩解[8-9]。本研究对体外对人乳腺癌MCF-7细胞进行培养，观察组细胞中加入不同浓度的苦参碱溶液，对照组细胞中加入等量的培养液。

本研究发现，加入苦参碱溶液处理24 h后的MCF-7细胞凋亡率显著高于等量的培养液的MCF-7细胞凋亡率，且随着苦参碱溶液浓度的升高MCF-7细胞凋亡率不断升高。研究说明了苦参碱溶液对MCF-7细胞凋亡有明显的促进作用，能够促进MCF-7细胞的凋亡。其机制可能为苦参碱会影响线粒体的跨膜电位的MMP通道，其会导致MMP通道打开，从而触发细胞凋亡的发生[10]。或可能是通过改变线粒体的膜内外的离子浓度，从而使细胞的跨膜电位发生崩溃，促使MMP通道发生开放，导致内外膜中的许多离子发生逆流，进而触发细胞凋亡的产生。本研究表明苦参碱溶液对于MGF-7细胞的抑制率结果为随着时间与浓度的增加，苦参碱对于MGF-7细胞抑制率效应也随之增强，抑制率逐渐增强；同时也说明苦参碱处理能够明显抑制细胞的生长，且与浓度呈正相关，浓度越高则抑制率越高。Rh123会从线粒体中释放出来，从而会发出黄绿色的荧光，荧光可由流式细胞仪进行检测[11-12]。进而通过荧光信号强弱能够检测细胞线粒体的膜电位所发生的变化以及监测凋亡的发生与否[13]。

本研究显示，苦参碱溶液能够对MCF-7细胞凋亡有明显的促进作用，能够促进MCF-7细胞的凋亡，明显抑制细胞的生长，同时可以明显降低罗丹明染色阳性数，且作用能力与浓度呈正相关。

综上所述，苦参碱对人乳腺癌MCF-7细胞有促凋亡的作用，其促凋亡的作用可能是通过降低线粒体跨膜电位而使MMP的通道打开。

[1] 鲍娇琳，陆金健，陈修平，等.苦参碱与氧化苦参碱抗肿瘤作用及其机制的研究进展[J].中药新药与临床药理，2012，23(3)：369-373.

′[3] 陈晓峡，向小庆，叶红，等.苦参碱及氧化苦参碱抗肿瘤作用的研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2013，19(11)：361-364.

[4] 罗应，李利军，邓春燕，等.硅溶胶-纳米金修饰金电极电化学发光法测定苦参碱的研究[J].分析测试学报，2013，32(1)：74-78.

[5] Gray GK,Therapeutic CK2 inhibition attenuates diverse prosurvival signaling cascades and decreases cell viability in human breast cancer cells[J].Oncotarget.2014,5(15):6484-6496.

[6] 高艳，郑萍，闫琳，等.苦参碱对大鼠慢性酒精性肝损伤的作用及初步机制研究[J].中国药理学通报，2013，29(7)：1012-1016.

[7] 官妍，马越，程惠娟，等.苦参碱对表皮葡萄球菌生物被膜作用初探[J].微生物学通报，2011，11(1)：91-96.

[8] 闫晓方，许伟，高吉照，等.苦参碱联合顺铂对SH-SY5Y细胞药物敏感性及TrkB表达的影响[J].临床儿科杂志，2012，30(5)：456-459.

[9] 桂蜀华，付涛，梁远园，等.苦参碱体外抗真菌活性研究[J].中药新药与临床药理，2011，22(4)：382-385.

[10] 张俊，唐安洲.苦参碱及其衍生物对人鼻咽癌细胞的耐药逆转作用[J].中药材，2012，35(12)：1989-1994.

[11] 马小花，魏玉辉，王丹，等.苦参碱大鼠肠吸收动力学研究[J].中成药，2011，33(10)：1695-1699.

[12] 莫利锋，郅军锐，张骏，等.苦参碱及吡虫啉对南方小花蝽的影响[J].植物保护学报，2013，40(2)：160-164.

[13] Hamada T,Anti-apoptotic Effects of PCP4/PEP19 in Human Breast Caner Cell Lines: A Novel Oncotarget.Oncotarget.2014 Aug 15;5(15):6076-6086.

(编校：谭玲,王冬梅)

Analysis of induced apoptosis effect of matrine on human breast cancer MCF-7 cell and its effect on mitochondrial transmembrane potential

GU Mu-ren1,LI Jun-bai1,ZHANG Xiao-hua2Δ,YIN Yong-mei3

(1.Department of Tumor Oncology, Theorem Clinical Medical College, Wenzhou City Hospital, Wenzhou 325000, China; 2.Department of Tumor Surgery, First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical, Wenzhou 325000, China; 3.Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China)

ObjectiveTo study the effect and the analysis of matrine for induced apoptosis in breast cancer MCF-7 cells and mitochondrial transmembrane potential.MethodsBreast cancer MCF-7 cells were cultured in vitro,then they were divided according to the random number to observation goup and control group.The observation goup were treated by different concentrations of matrine solution, and control group were added an equal amount of broth.Apoptosis and mitochondrial membrane potential of MCF-7 cells were detected by flow cytometry (FCM) detection, the inhibition rate of MCF-7 cells was detected by MTT.ResultsMCF-7 cell apoptosis rate in observation goup was significantly higher than that in control group after 24h, and there were statistically significant (P<0.05), it increased as the concentration had increased; inhibition rate of matrine for MGF-7 cell showed that inhibition rate had increased with time and concentration of matrine, and there was a statistically significant (P<0.05); Rhodamine staining positive number in observation group was less than the control group, and there were statistically significant (P<0.05), and the number of positive Rhodamine staining increased as the concentration had increased. ConclusionMatrine can promote apoptosis for human breast cancer MCF-7 cells, the effect may be caused by reducing mitochondrial transmembrane potential and leaving the MMP channel open.

matrine; breast cancer; mitochondrial transmembrane potential

国家自然科学基金(81172503)

谷牧人，女，硕士，主治医师，研究方向：肿瘤内科，E-mail：qch1821460067@163.com；张筱骅，通讯作者，男，本科，主任医师，研究方向：肿瘤外科，E-mail：qch1821460068@163.com。

R248.2

A

1005-1678(2015)02-0039-03