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miR-18a和雌激素受体α在单发及多发子宫肌瘤中的表达

2015-07-07廖治肖洪涛

中国生化药物杂志 2015年9期
关键词:单发平滑肌阳性细胞

廖治,肖洪涛

(1.电子科技大学附属医院·四川省人民医院 妇产科,四川 成都 610072;2.电子科技大学附属医院·四川省人民医院 药学部,四川 成都 610072)



miR-18a和雌激素受体α在单发及多发子宫肌瘤中的表达

廖治1,肖洪涛2

(1.电子科技大学附属医院·四川省人民医院 妇产科,四川 成都 610072;2.电子科技大学附属医院·四川省人民医院 药学部,四川 成都 610072)

目的 检测单发及多发子宫肌瘤组织中miR-18a及雌激素受体α(estrogen receptor alpha,ERα)的表达,探讨miR-18a与ERα的关系及2者在单发及多发子宫肌瘤发生中的作用。方法 采用原位杂交法检测miR-18a在单发及多发子宫肌瘤组织石蜡切片中的表达;采用免疫组化法检测ERα在单发及多发子宫肌瘤组织石蜡切片的表达。采用相关分析研究miR-18a和ERα的表达相关性。结果 多发子宫肌瘤组织中的ERα表达水平均明显高于单发子宫肌瘤组织(P<0.05);但miR-18a水平明显低于单发子宫肌瘤组织(P<0.05);相关分析结果表明,2者表达呈负相关(r单发=-0.4421,r多发=-0.4181)。结论 多发性子宫肌瘤中miR-18a的表达更低,ERα表达更高。miR-18a可作为治疗多发性子宫肌瘤的新靶标。

miR-18a;雌激素受体α;多发子宫肌瘤;单发子宫肌瘤

子宫肌瘤是妇科常见良性肿瘤,其发病率呈逐年上升趋势,但其病因、发病机制至今尚未完全明了。目前认为子宫肌瘤是一种激素依赖性良性肿瘤,在子宫肌瘤生长过程中,雌激素、孕激素的细胞作用主要为诱导转录、合成调节、分化蛋白质,而这一作用是雌、孕激素通过作用于靶器官内的雌激素受体(estrogen receptor,ER)、孕激素受体(progesterone receptors,PR)产生的。人的ER有2种亚型即ERα和ERβ,ERα作为雌激素受体之一对子宫肌瘤的发生发展起到关键作用。临床上常见的肌瘤以多发性子宫肌瘤为主,但也有一部分单发性子宫肌瘤。以往分子生物学研究结果提示[1-3],单发性子宫肌瘤是由单克隆平滑肌细胞增殖而成;多发子宫肌瘤是由不同克隆细胞形成;但是在分子及体液机制下是否有其他的调控异常,目前尚不明确。

microRNA(miRNA)是一种广泛存在于真核生物细胞中的非编码单链小分子RNA,参与多种肿瘤的发生、发展及转移过程[4],并与肿瘤的预后密切相关,是肿瘤早期诊断及判断预后的良好指标[5-6]。miR-18a的表达异常在肝细胞癌、结肠癌、妊娠期高血压疾病等多种疾病中得到证实。研究发现在疾病发生发展过程中miR-18a与ERα之间有靶向调节关系[7-9]。

本课题组之前的研究表明[10],ERα可能是miR-18a的靶基因之一,ERα在子宫肌瘤中的高表达是由于miR-18a的下调引起的。miR-18a和ERα与子宫肌瘤发病具有一定的相关性。为进一步了解miR-18a和ERα在单发及多发子宫肌瘤中的表达差异,以探索可能的作用机制,本文旨在检测miR-18a和ERα在单发及多发中的表达,探讨2者相关性,为治疗子宫肌瘤提供新的依据和线索。

1 资料与方法

1.1 一般资料 随机选择四川省人民医院2014年1月~2014年7月因子宫肌瘤入院行子宫全切或肌瘤挖除术的患者60例,其中单发性子宫肌瘤30例,多发性子宫肌瘤(≧2个)30例,患者平均年龄(40.2±4.5)岁;取样的子宫肌瘤直径均>5 cm,取其切除的肌瘤组织的病理存档蜡块。入选患者术前3个月内未服用任何激素类药物,未合并其他疾病,术后病理诊断均为子宫平滑肌瘤。

1.2 主要实验试剂 Has-miR-18a miRCURY LNA Detection probe、地高辛(DIG)标记LNA-miR-18a均购自Exiqon公司;兔抗人ERα(Millipore)、羊抗兔Ⅱ抗(Abcam)购自Abcam公司;SP免疫组化染色试剂盒、DAB酶底物显色试剂盒、抗原修复液均购自成都正能生物技术有限公司;无水乙醇、多聚甲醛、苏木素为国产分析纯。

1.3 方法 全部标本均为10%福尔马林固定、石蜡包埋的子宫肌瘤组织标本,切片厚4 μm。

1.3.1 原位杂交检测miR-18a的表达:取石蜡包埋组织去石蜡、水化、柠檬酸盐抗原修复,49.5 ℃,杂交缓冲液中预杂交2 h,加入DIG labeled miRCURYTMprobes过夜。加入HRP标记的抗地高辛抗体(1:200),4 ℃孵育过夜。TBST冲洗,在暗室中加染色溶液,孵育24 h。当达到期望的亮度时,将载玻片移至终止液(1 mM EDTA-PBS溶液)终止反应,苏木素复染。

1.3.2 免疫组织化学法检测ERα的表达:石蜡组织块脱蜡、水化后,微波处理使抗原激活。按照抗体说明书要求加入抗体,二氨基联苯胺(DAB)显色。阳性结果呈棕黄色。

1.4 结果判定标准 原位杂交及免疫组织化学结果应用Image-Pro Plus(IPP )软件进行分析,测量平均光密度(即时IOD/area);根据胞浆阳性细胞数以及染棕黄色及黄色数的多少来划分等级,染色分布弥散且阳性细胞>50%为强阳性(+++),阳性细胞为25%~50%为阳性(++),阳性细胞10%~25%为弱阳性(+),阳性细胞<5%或不染色为阴性(-)。

2 结果

2.1 miR-18a在单发及多发子宫肌瘤平滑肌细胞中的表达 原位杂交结果显示,miR-18a在单发及多发子宫肌瘤平滑肌细胞中均有表达,miR-18a阳性表达定位于细胞核内,为棕黄色染色,见图1。多发子宫肌瘤肌细胞中miR-18a平均光密度为82.38±4.26,显著低于其在单发子宫肌瘤肌细胞中的表达,为95.11±3.56,差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 miR-18a在多发子宫肌瘤(A)和单发子宫肌瘤(B)中的表达(×200)Fig.1 Expression of miR-18a in multiple uterine fibroids(A) and single uterine fibroids(B) (×200)

2.2 ERα在单发及多发子宫肌瘤平滑肌细胞中的表达 ERα在单发及多发子宫肌瘤平滑肌细胞中均有表达,ERα阳性表达定位于细胞核内,为棕黄色染色,见图2。多发子宫肌瘤肌细胞中ERα表达水平的平均光密度值为354.47±18.57,显著高于其在单发子宫肌瘤肌细胞中的平均光密度值322.15±24.1,比较差异有统计学意义(P<0.05)。

图2 ERα在多发子宫肌瘤(A)和单发子宫肌瘤(B)中的表达(×200)Fig.2 Expression of ERα in multiple uterine fibroids(A) and single uterine fibroids(B) (×200)

2.3 子宫肌瘤中miR-18a表达与ERα表达的相关性 miR-18a与ERα在单发及多发子宫肌瘤中的表达均呈负相关(r=-0.4211,P<0.05;r=-0.4181,P<0.05)。见表1、表2。

表1 miR-18a与ERα在单发子宫肌瘤中的计数表达(n=30)Tab.1 miR-18a and ER alpha count in single uterine fibroids(n=30)

*P<0.05

表2 miR-18a与 ERα在多发子宫肌瘤中的计数表达(n=30)Tab.2 miR-18a and ER alpha count in multiple uterine fibroids(n=30)

*P<0.05

3 讨论

子宫平滑肌瘤是雌激素依赖性疾病,已有研究证实肌瘤组织中ER、mRNA表达成倍增加,雌激素通过其受体ERα和ERβ发挥生物学效应,子宫肌瘤的发生与患者局部内分泌环境异常有关,在女性子宫中以ERα为主[11],尽管外周血中雌激素水平相似,但是局部组织受体密度可能决定其最终效应。ERα作为雌激素受体之一对子宫平滑肌瘤的发生、发展起到关键作用。

miRNA广泛参与了人类及各种生物的生理病理过程,肿瘤的发生中miRNA也起着重要的作用。有关子宫肌瘤发生中miRNA的报道最早见于2007年,一个miRNA可以调节多个靶基因的表达,几种miRNA也可以共同调控一个靶基因的表达。miRNA主要通过与靶mRNA的3′-非翻译区(3′-UTR)互补配对而负调控基因表达,当miRNA和目的mRNA完全互补时,降解目的mRNA;当不完全互补时,则负向调控翻译过程,阻碍蛋白质翻译[12-13]。在子痫前期孕妇胎盘组织中发现miR-18a的病理性低表达[14-16],并且初步预测出其靶基因是ERα。但在子宫肌瘤中这2者的相关性研究仍然较少。本课题组之前的研究发现,miR-18a在子宫肌瘤中表达下降,ERα则在肌瘤组织中高表达。且在同一位患者样本中,miR-18a在子宫肌瘤组织中低表达,而ERα在肌瘤组织中高表达,表明2者之间存在负向调节。这种负向调节暗示ERα可能是miR-18a的靶基因之一,即ERα在子宫肌瘤中的高表达是由于miR-18a表达下调引起的。因此miR-18a和ERα与子宫肌瘤发病存在一定的联系。

本研究分单发及多发子宫肌瘤2组,且肌瘤直径均在5 cm以上,结论提示多发子宫肌瘤的ERα表达水平均明显高于单发子宫肌瘤,但miR-18a水平则比单发子宫肌瘤组织中的表达弱;同一肌瘤组织中这2者表达呈负相关。说明多发性子宫肌瘤中miR-18a的缺失更明显,可能导致多发肌瘤中ERα表达水平进一步增加。ERα的增多放大了雌激素的作用,肌瘤局部的“高雌激素受体环境”加速了靶细胞分裂、增殖,可能启动了子宫肌瘤的发生且同时导致肌瘤多发;而其上游调控基因miR-18a通过影响ERα表达参与子宫肌瘤的发生发展过程。

本研究结果表明miR-18a可能成为治疗子宫肌瘤的新靶标,为揭示其发病分子机制和治疗子宫肌瘤提供了新线索。但miRNAs作为基因调控机制中一个新成员,其具体调控机制还有待进一步研究,这将是下一步研究的方向。

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(编校:吴茜)

MiR-18a and estrogen receptor alpha expression in single and multiple uterine fibroids

LIAO Zhi1, XIAO Hong-tao2

(1 Department of Gynecology and Obstetrics, Hospital of the University of Electronic Science and Technology of China, Sichuan Provincial People’s Hospital, Chengdu 610072, China;2.Department of Pharmacy, Hospital of the University of Electronic Science and Technology of China, Sichuan Provincial People’s Hospital, Chengdu 610072, China)

ObjectiveTo detect the expression of miR-18a and estrogen receptor alpha (ER alpha) in single and multiple uterine flesh tumor tissues, discuss the relationship between miR-18a and ER alpha, and their effect in single and multiple uterine fibroids.MethodsThe expression of miR-18a and ER alpha in single and multiple uterine fibroids tissue paraffin section were detected by in situ hybridization method and immunohistochemical method, respectively.And the correlation between the miR-18a and ER alpha were evaluated.ResultsThe expression of ER alpha in multiple uterine fibroids group was significantly higher than that of single uterine fibroids tissues (P<0.05); while miR-18a was weaker than that of single uterine fibroids tissues(P<0.05).The correlation results showed that miR-18a expression was correlated negatively with ER alpha expression either in single(r=-0.4421) and multiple uterine fibroids(r=-0.4181).ConclusionThe expression of miR-18a is low in multiple uterine fibroids, while ER alpha had high expression.miR-18a could bea new target for the treatment of multiple uterine fibroids.

miR-18a; estrogen receptor alpha.multiple uterine fibroids; single uterine fibroids

四川省卫生厅项目(100491,120111),四川省人民医院青年基金(30305030606,30305030859);四川省科技厅项目(2014FZ0103,2015JQO027,2015ZR0160)

廖治,女,硕士,副主任医师,研究方向:妇产科,E-mail:liaozhi130@163.com;肖洪涛,通讯作者,男,博士,副主任药师、副研究员,研究方向:临床药理学,E-mail:xht927@163.com。

R737

A

1005-1678(2015)09-0054-03

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