汪颖，赵赋，张晶，王博，张琪，孙异临，刘丕楠,*

盐酸埃克替尼诱导NF2神经鞘瘤细胞增殖和凋亡研究

汪颖1，赵赋1，张晶1，王博2，张琪1，孙异临1，刘丕楠1,2*

（1.首都医科大学北京神经外科研究所，北京100050；2.首都医科大学附属北京天坛医院，北京100050）

探讨盐酸埃克替尼对2型神经纤维瘤病（NF2）神经鞘瘤细胞增殖和凋亡的影响。运用0～80 μmol·L-1盐酸埃克替尼处理NF2听神经鞘瘤原代细胞及大鼠神经鞘瘤细胞系RT4，孵育48 h后通过CCK8比色法检测药物对细胞增殖活力的影响；流式细胞仪检测药物对细胞凋亡的影响；电子显微镜观察药物处理后细胞显微结构变化；同时应用免疫印迹法及实时定量PCR观察凋亡相关蛋白表达情况。盐酸埃克替尼作用后，细胞增殖活性显著降低，呈剂量依赖性。流式细胞仪检测，10、20、40、80 μmol·L-1盐酸埃克替尼作用48 h后，凋亡率分别为（6.10± 0.35）%、（10.52±0.87）%、（11.78±0.63）%、（16.05±1.02）%。免疫印迹检测发现，半胱氨酸蛋白水解酶3（Caspase-3）剪切体增多，实时定量PCR结果显示bcl-2基因表达降低，bax基因表达增加。结果表明，盐酸埃克替尼能通过活化Caspase-3及调控bcl-2、bax基因表达诱导细胞凋亡而抑制神经鞘瘤细胞增殖。

盐酸埃克替尼；2型神经纤维瘤病；神经鞘瘤；表皮生长因子受体

2型神经纤维瘤病（Neurofibromatosis type 2，NF2）为抑瘤蛋白Merlin缺失导致的全身多发肿瘤综合征，外科手术不能有效抑制全身肿瘤，术后并发症（如听力丧失，面瘫等）较多，可严重影响患者生活质量[1-2]。Cole等研究显示Merlin可负向调控表皮生长因子受体（EGFR）通路，提示EGFR或为NF2肿瘤潜在治疗靶点[3]。研究者尝试将EGFR抑制剂用于NF2患者治疗并取得初步疗效[4]，但此类药物价格昂贵。盐酸埃克替尼为我国自主研发的一种靶向EGFR的酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI），现已用于晚期非小细胞肺癌的治疗[5-6]，但对NF2肿瘤治疗效果不详。因此，本研究首先在细胞水平上检测盐酸埃克替尼对NF2神经鞘瘤细胞毒性作用并探讨其可能机制，以评估其应用于NF2肿瘤临床治疗的可能价值。

1 材料与方法

1.1 临床资料

收集首都医科大学附属北京天坛医院神经外科2013年9月～2014年12月NF2患者听神经鞘瘤新鲜手术标本5例进行原代细胞培养[7]，所有标本均经术后病理确诊。

1.2 主要仪器及试剂

大鼠神经鞘瘤细胞系RT4购自ATCC；胎牛血清（FBS）（购自美国Gibico公司）；DMEM培养液（购自美国Gibico公司）；CCK8试剂盒（购自日本同仁）；细胞周期检测试剂盒（购自四正柏公司）；细胞凋亡检测试剂盒（购自四正柏公司）；蛋白裂解液（RIPA）（购自北京普利来基因技术公司）；蛋白定量检测试剂盒（购自北京普利来基因技术公司）；Caspase-3剪切体抗体购自abcam，β肌动蛋白抗体（β-actin）购自北京普利来基因技术公司；盐酸埃克替尼由浙江贝达药业惠赠。

1.3 方法

1.3.1 EGFR基因突变检测

从冻存的NF2听神经瘤标本中提取DNA，PCR扩增35个循环，退火温度60℃。反应所需引物序列如下：第19号外显子上游引物5'GTG CATCGCTGGTAACATCCAC 3'，下游引物5'CAGA GCAGCTGCCAGACATGAG 3'，扩增19号外显子247 bp；第20号外显子上游引物5'CCATGAGTAC GTATTTTGAAACTC 3'，下游引物5'TTATCTCCC CTCCCCGTATC 3'，扩增20号外显子317 bp；扩增第21号外显子上游引物5'CTGAATTCGGATG CAGAGCTTC 3'，下游引物5'GAGAGCATCCTC CCCTGCATGTG 3'，扩增21号外显子307 bp；引物由深圳华大基因科技服务有限公司合成及测序，结果与基因库EGFR基因序列进行比对。

1.3.2 CCK8法评价盐酸埃克替尼对神经鞘瘤细胞增殖的抑制作用

取对数生长期细胞，接种于96孔板中，100 μL·孔-1，每孔细胞数1 500个。含10%FBS的DMEM培养液培养24 h，细胞贴壁后弃上清，每组3个复孔。分别设置空白组及不同浓度给药组：10、20、40和80 μmol·L-1。给药后37℃，5%CO2继续培养48 h，每孔加入100 μL含10%CCK8混合液，37℃孵育2 h，应用酶标仪测定吸光度值。

1.3.3 Ca2+依赖性脂结合蛋白（Annexin V）/碘化丙啶（PI）法检测盐酸埃克替尼对细胞凋亡的作用

取对数生长期细胞，分别将细胞接种于96孔板中，2×105个细胞·孔-1。含10%FBS培养液培养24 h，加药后继续培养48 h。收集每孔细胞，分别加入10 μL PI和5 μL Annexin V，室温避光反应15 min后，流式细胞仪分析凋亡细胞比例。

1.3.4 电镜观察盐酸埃克替尼作用后细胞超微结构变化

细胞经戊二醛前固定，1%锇酸后固定，50%、70%乙醇逐级脱水，80%、90%、100%丙酮逐级脱水，100%丙酮∶环氧树脂Epon812包埋机以1∶1混合置换，环氧树脂Epon812包埋剂37℃浸透过液。将组织置包埋膜内Epon812包埋剂包埋。在解剖显微镜下修块，切片，HE染色，定位，切片，捞片。70%乙醇配制的饱和醋酸铀染色，铅染液染色。干燥后电镜观察。

1.3.5 蛋白免疫印迹法检测盐酸埃克替尼对凋亡通路的影响

取对数生长期细胞，以2×105个细胞·孔-1接种于六孔板中培养24 h，给药后继续培养48 h，用蛋白裂解液（RIPA）分别提取细胞总蛋白。分别检测Caspase-3剪切体、β-actin蛋白表达。Western印迹试验结果应用美国Bio-Rad公司Quantity One软件进行扫描分析。

1.3.6 RT-PCR检测盐酸埃克替尼对bcl-2、bax基因表达影响

收获不同浓度盐酸埃克替尼作用后的细胞采用TRIzol试剂提取细胞总RNA，oligo（dT）15将其逆转录成cDNA后，PCR扩增细胞mRNA中的bcl-2、bax、gapdh基因，所用引物由深圳华大基因科技服务有限公司合成（见表1）。PCR反应按照Realtime PCR试剂盒SYBR Premix Dimer EraserTM说明书进行。总体积20 μL，SYBR Premix Dimer EraseTM（2×）10 μL，PCR Forword Primer（10 μmol·L-1）0.6 μL，PCR Reverse Primer（10 μmol·L-1）0.6 μL，Template（＜500 ng）2 μL，ddH2O（灭菌蒸馏水）6.4 μL。扩增条件：95℃，30 s；95℃，5 s；55℃，20 s；72℃，15 s；共40个循环。

表1 RT-PCR引物序列Table1Primers list of RT-PCR

1.4 统计学方法

采用Graphpad prism 5.0统计学软件进行数据处理和分析，计量资料以X±S表示，组间比较采用独立样本t检验，P≤0.05差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 NF2听神经鞘瘤EGFR突变类型检测

在检测的13例NF2听神经瘤标本中，测序结果与标准序列进行比对，结果未在EGFR常见突变的19、20或21号外显子中发现有基因突变。

2.2 盐酸埃克替尼对神经鞘瘤细胞的增殖抑制作用

经盐酸埃克替尼作用48 h后，与未加药对照组相比，原代NF2听神经鞘瘤细胞、大鼠神经鞘瘤细胞系RT4生长均受到明显抑制，且呈剂量依赖性（见图1）。

图1 盐酸埃克替尼以剂量依赖方式抑制神经鞘瘤细胞增殖Fig.1Icotinib inhibits the proliferation of schwannoma cells in a dose dependent manner

2.3 盐酸埃克替尼诱导神经鞘瘤细胞的凋亡

细胞胞浆膜不对称性丧失导致磷脂酰丝氨酸（PS）外翻是细胞凋亡的早期过程，Annexin V可与PS特异性结合，用于早期细胞凋亡检测。对药物作用后的RT4细胞进行Annexin V-FITC，PI双标检测显示，与未加药组相比，盐酸埃克替尼作用后，细胞凋亡比例明显增高，盐酸埃克替尼作用48 h后，0、10、20、40、80 μmol·L-1各剂量组细胞凋亡率分别为：4.52%±0.32%、6.10%±0.35%、10.52%±0.87%、11.78%±0.63%、16.05%±1.02%。结果显示，盐酸埃克替尼可诱导神经鞘瘤细胞凋亡，且呈剂量依赖关系，即随剂量增加，其发生凋亡细胞率也逐渐增高（见图2）。

2.4 透射电子显微镜观察细胞凋亡的超微结构

未经盐酸埃克替尼处理的RT4细胞在透射电子显微镜下观察可见细胞包膜完整，胞质均匀，细胞核圆且居中，核仁明显。核内染色体分布均匀，常染色质丰富，沿细胞核膜分布。而经80 μmol·L-1盐酸埃克替尼作用48 h后，细胞则呈现细胞核皱缩且形状不规则，并出现染色质凝集、边聚，核碎裂及凋亡小体（见图3）。

图2 盐酸埃克替尼诱导神经鞘瘤细胞凋亡Fig.2Icotinib increases apoptosis of schwannoma cells

图3 盐酸埃克替尼诱导神经鞘瘤细胞形成凋亡小体Fig.3Transmission electron microscopy(TEM)shows apoptosis body in the schwannoma cells treated with icotinib

2.5 盐酸埃克替尼通过活化Caspase-3及调控bcl-2,bax基因表达水平诱导凋亡

80 μmol·L-1盐酸埃克替尼处理RT4细胞48 h后，提取其总蛋白，Western-blot检测Caspase-3剪切体表达，由图4A中可知，盐酸埃克替尼可上调Caspase-3剪切体表达，且随浓度增加作用增强。RT-PCR检测bcl-2、bax基因表达结果显示（见图4B），盐酸埃克替尼作用后可诱导bcl-2表达下调，bax表达上调。

图4 盐酸埃克替尼通过诱导Caspase-3活化及调控bcl-2，bax基因表达水平诱导凋亡Fig.4Icotinib increases apoptosis of schwannoma cells associated with an increased expression of cleaved-Caspase-3 and altered expression of bcl-2，bax genes

3 讨论与结论

2型神经纤维瘤病为NF2基因突变导致其编码抑瘤蛋白Merlin功能缺失而致的常染色体显性遗传疾病，长期持续病变严重影响患者生存质量及寿命。目前该病治疗总体仍以传统手术切除为主，而不能阻止肿瘤新生，因此患者终生受病痛折磨并面临不断手术的困境[8]。Curto等研究显示，Merlin可抑制活化的EGFR分子内化、再循环及新的EGFR亚基运输到细胞表面，从而调控细胞增殖[9-10]。在Merlin缺失的神经鞘瘤细胞表面也检测到有EGFR高表达[11]。学者开始尝试使用EGFR抑制剂用于NF2临床治疗，但效果不一。彭涛等研究认为，盐酸埃克替尼为一口服的小分子EGFR-TKI，主要通过竞争EGFR胞内区酪氨酸的ATP结合位点，进而抑制EGFR自发磷酸化作用，阻断下游信号通路活化[12]。该药可选择性抑制EGFR野生型及突变体（L858R，L861Q），对其他激酶无明显抑制作用[13]，故本研究首先对13例NF2听神经鞘瘤标本EGFR的19、20、21号外显子进行测序，未发现有突变发生，为野生型，属该药作用范畴。试验结果也证实盐酸埃克替尼可抑制NF2听神经鞘瘤原代细胞及RT4细胞系增殖，且随药物作用浓度提高，抑制作用增强，呈剂量依赖性。但作用浓度过大时（160 μmol·L-1），细胞增殖完全抑制，毒性作用明显；作用浓度过低时，无抑制作用（5 μmol·L-1）（阴性结果，未提供）。本研究采用流式细胞术分析药物作用后对细胞凋亡的影响，结果证实盐酸埃克替尼作用后与空白对照组相比，早期凋亡比例和晚期凋亡比例均显著增加，说明盐酸埃克替尼对神经鞘瘤细胞增殖的抑制作用可能是通过启动细胞凋亡实现。而透射电子显微镜观察结果也显示盐酸埃克替尼作用会促进凋亡小体形成。

凋亡发生是由Caspase家族成员介导的蛋白酶级联反应过程[14]，Caspase-3是多种凋亡途径的共同下游效应部分[15]，在细胞凋亡过程中占据核心地位，被称为“死亡执行蛋白酶”[16]。本研究表明，经盐酸埃克替尼作用后，神经鞘瘤细胞Caspase-3明显激活。而Bcl-2家族的表达和调控是影响细胞凋亡的另一关键因素[17]，研究表明，Caspase-3能裂解Bcl-2蛋白，从而触发细胞凋亡。本试验中也发现经盐酸埃克替尼作用后，bcl-2基因表达下调，bax基因表达上调。以上结果表明，盐酸埃克替尼可通过启动Caspase依赖的细胞凋亡途径及通过调控bcl-2，bax基因表达利于Caspase激活从而实现对细胞增殖的抑制。

本研究结果表明，盐酸埃克替尼可明显抑制NF2听神经鞘瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡，其机制与诱导Caspase-3活化及调控bcl-2，bax基因表达水平相关，为新型酪氨酸激酶抑制剂应用于NF2临床治疗提供理论依据。

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Study on icotinib of the proliferation and apoptosis of neurofibromato⁃sis type 2 related schwannoma cells/

WANG Ying1,ZHAO Fu1,ZHANG Jing1,WANG Bo2,ZHANG Qi1,SUN Yilin1,LIU Pinan1,2(1.Beijing Neurosurgical Institute,Capital Medical University, Beijing 100050,China;2.Beijing Tiantan Hospital,Affiliated of Capital Medical University,Beijing 100050,China)

To explore the role of icotinib on the proliferation and apoptosis of neurofibromatosis type 2 (NF2)related schwannoma cells.Primary cultured NF2 related human schwannoma cells and rat schwannoma cell line RT4 cells were treatedin vitrowith icotinib at a concentration gradient of 0-80µmol·L-1, and its role on the cell proliferation and apoptosis were analyzed by the CCK8 assay and flow cytometer, respectively.The ultrastructural changes was evaluated by electron microscopy,and apoptosis-related proteins and genes were detected using Western-blot and RT-PCR.Results showed that icotinib inhibites the proliferation of primary NF2-related schwannoma cells and RT4 cells in a dose dependent manner,after treatment with 10,20,40 and 80µmol·L-1icotinib for 48 h,the rates of cell apoptosis were(6.10±0.35)%,(10.52±0.87)%,(11.78±0.63)%and(16.05±1.02)%,respectively.These effects were associated with an increased expression of cleaved-Caspase-3 and altered expression ofbcl-2,baxgenes.Thus,icotinib may plays a role in inhibiting proliferation,and increasing apoptosis of schwannoma cells.

icotinib;neurofibromatosis type 2;schwannoma;EGFR

R739.4

A

1005-9369（2015）07-0057-05

时间2015-7-9 14:42:45[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20150709.1442.011.html

汪颖,赵赋,张晶,等.盐酸埃克替尼诱导NF2神经鞘瘤细胞增殖和凋亡研究[J].东北农业大学学报,2015,46(7)∶57-61.

Wang Ying,Zhao Fu,Zhang Jing,et al.Study on icotinib of the proliferation and apoptosis of neurofibromatosis type 2 related schwannoma cells[J].Journal of Northeast Agricultural University,2015,46(7)∶57-61.(in Chinese with English abstract)

2015-01-15

国家自然科学基金项目（81372715）

汪颖（1986-），女，博士，研究方向为肿瘤免疫及生物治疗。E-mail:wangying_cams@163.com

*通讯作者：刘丕楠，教授，博士生导师，研究方向为颅脑肿瘤。E-mail:liupinan@gmail.com