丁 伟，周 葱，刘 超，何家轩，贾 兵，朱立武

（安徽农业大学 园艺学院，合肥230036）

赤霉素（gibberellins acid，GA）是一类存在于植物整个生命周期的内源激素，调控植物的生长发育过程。GA 可促进细胞分裂和伸长，诱导开花，打破植物休眠，促进雌花分化，增强细胞内生长素IAA水平从而促进养分积累，促进某些梨树座果和单性结实，延缓叶片衰老等［1－2］。GA2－氧化酶（GA2－oxidase，GA2ox）是GA 合成过程中关键调控酶，以2－酮戊二酸和氧分子为底物、Fe2＋和抗坏血酸为辅助因子的双加氧酶，在GA 合成过程中，将活性GA 氧化为无活性GA，维持着植物体内生物活性GA 和无活性GA 的平衡，受GA 正反馈调节［3－4］。

DELLA蛋白是一类C 端非常保守、N 端含有Asp－Glu－Leu－Leu－Ala结构域的蛋白质家族。DELLA 蛋白定位于细胞核内，与某种转录因子结合，对基因转录起阻遏作用，抑制赤霉素效应，间接或直接调节GA 响应基因的转录［5］。Fu等［6－9］发现DELLA 蛋白对赤霉素、茉莉酸、脱落酸、乙烯和生长素等多种激素的信号转导过程都有抑制作用，抑制植物的发育；Achard等［10］研究拟南芥DELLA 蛋白在植物激素处理和逆境胁迫下的变化，结果发现DELLA 蛋白可以实时调节植物生长以响应外界环境变化，以此提高植物的抗逆性。

GID1（gibberellin insensitive dwarf）是一种GA 受体，定位于细胞核内，是一种可溶性受体［11］。GID1与活性GA 结合形成GA－GID1二聚体，二聚体上N端构象发生改变，易于同DELLA 蛋白连接，形成GA－GID1－DELLA三聚体，然后SCF 聚合体标记该三聚合体，诱导泛素26S蛋白酶体降解DELLA 蛋白，解除DELLA 蛋白对基因转录的阻遏作用，产生“赤霉素效应”［12－14］。

‘砀山酥梨’种植面积约占中国梨栽培面积的1／4，其主产区在西北和黄河故道地区。该地区梨园缺铁现象严重影响了梨品质和产量的提高［15－16］。Romheld等［17］研究发现，缺铁胁迫导致向日葵根系的IAA 含量显著提高，Li等［18］用IBA 或IAA 处理正常供铁植物，发现能诱导类似植物的高铁还原酶的活性。Romera［19］将乙烯合成前体ACC 加入缺铁植株后，显著促进高铁还原酶活性和根毛发育。Graziano［20］则研究了NO 对植物缺铁的调控，发现NO 能促进缺铁条件下植株的各种缺铁响应，但是不能诱导正常供铁植株产生缺铁相关的反应。

关于缺铁条件下GA 含量变化及其信号转导相关基因表达研究目前尚未见报道。试验以‘砀山酥梨’组织培养试管苗叶片为试材，测定不同程度缺铁胁迫下叶片内源GA 含量；采用RT－PCR 技术，分析GA 信号转导相关基因GA2ox、受体蛋白GID1的4个等位基因和DELLA 蛋白4个等位基因相对表达量变化；研究缺铁胁迫下梨叶片GA 水平和相关信号转导基因的关系，探讨GA 及其转导基因在梨树缺铁胁迫下的作用。

1 材料和方法

1．1 材 料

参考Pestana M 设计［21］，将‘砀山酥梨’组培生根苗移植至MS培养基，其中不含铁元素，Fe2＋浓度另设4个处理水平。Fe40：添加40μmol／L Fe－EDTA；Fe20：添加20μmol／L Fe－EDTA；Fe10：添加10μmol／L Fe－EDTA；Fe0：不添加Fe－EDTA。处理的苗木置于光照培养箱中，培养温度（白天／夜晚）25℃／20℃，光照时间每天15h，光照度2 100lx，相对湿度70%，培养28d后，Fe40叶片表现正常，Fe20叶片黄化不明显，Fe10 叶边缘出现明显的失绿，Fe0叶片黄化严重，呈黄白色（图1）。将不同处理叶片用液氮处理后，置于－80℃冰箱中保存备用［22］。

1．2 方 法

1．2．1 GA 含量测定 应用酶联免疫检测法ELISA（Enzyme－Linked ImmunoSorbent Assay）测定叶片中GA 含量［23］。

图1 不同铁离子含量培养基中叶片黄化症状程度Fig．1 Leaf with symptom of iron－deficiency at MS medium at different iron concentrations

1．2．2 总RNA提取与GA2ox基因克隆 总RNA提取使用StarSpin Plant RNA Mini Kit试剂盒（购自Genstar公司），cDNA合成使用M－MLV RTase cDNA Synthesis Kit（购自大连宝生物工程有限公司）。通过NCBI查找GA2ox基因的同源序列，根据同源序列的保守区域设计引物，进行PCR 扩增，将扩增得到的特异片段回收，送到上海生工生物工程公司进行测序，获得GA2ox基因的保守序列。根据保守序列按照TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司的3′－Full RACE Core Set with Prime ScriptTMRtase和5′－Full RACE Kit with Tap试剂盒设计引物进行扩增。PCR 扩增条件为94℃预变性10 min；94℃变性30s；52℃退火45s，72℃延伸1 min，共进行35个循环；72℃延伸10min。

1．2．3 实时荧光定量PCR 提取不同程度缺铁叶片的总RNA，经反转录获得mRNA 第一链。根据获得的GA2ox全长序列，以及从梨基因组数据库中得到GID1 的4 个等位基因为GID11（登录号Pbr006571．1）、GID13（登录号Pbr041942．1）、GID15（登录号Pbr019693．1）和GID16（登录号Pbr029795．1），DELLA蛋白4个等位基因DELLA1（登 录 号Pbr037895．1）、DELLA2（登 录 号Pbr040316．1）、DELLA4（登录号Pbr004513．1）和DELLA6（登录号Pbr037896．1）（http：／／peargenome．njau．edu．cn：8004／default．asp？d＝4＆m＝2），使用Premier 5．0软件设计荧光定量PCR 引物（表1）。使用ABI STEPONE荧光定量PCR仪和Takara 公司SYBR?PremixExTaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）试剂进行荧光定量PCR 分析，采用20μL 反应体系：SYBRTMPremixExTaq10μL，正、反向引物（10 μmol·L－1）各0．8μL，荧光染料0．4μL，cDNA 模板1μL，ddH2O 7．0μL。反应程序为95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火30s，共40个循环，每个样品4次重复。以GAPDH基因作为内参，使用2－△△Ct法求待测样品相对表达量。

表1 所用引物序列Table 1 The sequences of the primers used in the experiment

1．2．4 数据分析 利用SPSS 17．0软件对叶片中GA 含量、基因相对表达量差异进行分析。

2 结果与分析

2．1 不同程度缺铁叶片中GA 含量

各处理苗木培养28d后，Fe40叶片表现正常，Fe20 叶片黄化不明显，其GA 含量分别为7．29 ng／g和8．13ng／g，两者差异不显著。Fe10仅叶缘出现明显黄化，GA 含量显著高于Fe40与Fe20处理；而未添加Fe－EDTA 的叶片黄化严重，GA 含量也显著高于Fe10处理。由此可见，叶片内源GA 水平受到缺铁胁迫的影响，随着植株缺铁程度加重，叶片GA 含量增加（图2）。

2．2 GA 2ox 基因的克隆

对GA 氧化酶基因GA2ox进行克隆，首先得到保守序列，该扩增片段大小为576bp；将此序列在NCBI上进行BLASTn比对，结果它与西洋梨（登录号JF441168）的GA2ox最接近，一致性达到99%。3′－RACE扩增片段大小为536bp，比对结果与苹果（登录号FJ571521）的GA2ox基因一致性最大，达到97%；5′－RACE 扩增片段大小为585bp，与苹果（登录号FJ571521）的GA2ox基因一致性达到99%（图3）。

将2个片段拼接得到编码区全长1 014bp的基因，在NCBI上比对，发现与西洋梨的GA2ox（登录号JF441168）基因一致性达到99%。依据上述特征判断，本研究获得了‘砀山酥梨’GA2ox（登录号KJ008976）基因完整cDNA 全长序列，共含337 个氨基酸序列。

2．3 不同程度缺铁叶片中GA 2ox 基因差异表达分析

图2 不同缺铁处理叶片中内源GA 含量Fig．2 The endogenous GA content in leaves of different iron－deficiency treatment

Fe20处理的GA2ox基因相对表达量显著高于Fe40；Fe10和未添加Fe－EDTA的GA2ox基因相对表达量与Fe40 处理无显著差异。与正常植株相比，轻度的缺铁胁迫会使叶片GA2ox基因表达量增加；中度或重度缺铁时，GA2ox基因表达量并未呈现出显著差异（图4）。由此可见，缺铁胁迫并不一定能促进活性GA 向无活性GA 转化。

2．4 不同程度缺铁叶片中GA 受体GID1 等位基因表达分析

在不同程度缺铁叶片间，GID11 和GID13 的相对表达量均达到显著差异；而GID15 和GID16基因在Fe40和Fe20处理中相对表达量无显著性差异，随着缺铁程度的加重，两者相对表达量均显著高于Fe40处理（图5）。

相关分析结果显示，GA 含量与GA 受体蛋白GID1的4个等位基因相对表达量呈正相关，相关关系均达到显著水平，相关系数分别为0．987 6、0．987 6、0．982 4和0．983 9。

2．5 不同程度缺铁叶片中DELLA 蛋白等位基因表达

DELLA 蛋白的4个等位基因中，仅DELLA6在不同缺铁程度叶片间相对表达量差异不显著。DELLA1 在Fe20 与Fe10 处理中差异不显著；DELLA2在Fe10与Fe0、Fe40与Fe20处理中差异不显著；而DELLA4在Fe40、Fe20和Fe10处理中相对表达量无显著差异（图6）。

图3 GA2ox 基因cDNA 序列扩增Fig．3 Amplification of cDNA sequence of GA2oxgene

图4 不同缺铁处理叶片中GA 2ox 基因相对表达量Fig．4 Relative expression level of GA 2ox gene in leaves with iron－deficiency at different degrees

图5 不同缺铁处理对叶片中GID1等位基因相对表达量的影响Fig．5 Relative expression level of GID1alleles in leaves with iron－deficiency at different degrees

图6 缺铁处理对叶片中DELLA 蛋白等位基因相对表达量的影响Fig．6 Effect of the different iron－deficiency on the relative expression quantity of DELLA protein gene alleles

与DELLA 蛋白的其他3 个等位基因相比，DELLA1随着缺铁程度加重，相对表达量逐渐增加，说明DELLA1基因对缺铁胁迫比较敏感。

3 讨 论

3．1 缺铁胁迫条件下GA 的作用及与GA 2ox 基因的关系

梨树缺铁症状首先出现在幼叶上，轻者叶片边缘失绿黄化，重者整个叶片黄化，直至叶片全部变为黄白色、出现褐色锈斑且叶缘枯焦，引起叶片脱落，致使枝条枯死，甚至植株死亡［24］。Zhou等［25］发现GA 可以延缓叶片中叶绿素降解、缓解失绿；Lers等［26］研究认为GA 可以延缓蛋白质和RNA 的分解，延迟叶片衰老。

GA2ox基因是调控GA 分解的关键酶，它可以促进活性GA 转化为无活性GA。但是本试验发现，叶片内源GA 水平随着植株缺铁程度加重而增加，而GA2ox基因表达量并未随之上升。表明缺铁胁迫条件下，叶片中GA 的总量是增加，可能是缺铁诱导了内源GA 合成。在缺铁胁迫下，通过外源GA的应用是否能增加梨抗缺铁能力有待进一步研究。

3．2 缺铁胁迫叶片中GA 信号转导

本试验结果显示，GID1作为GA 的受体，在重度缺铁处理叶片中，其4个等位基因表达量均显著上调，与内源GA 含量显著上升相一致，使GA 与GID1结合成二聚体的数量增加。形成的GA－GID1二聚体，再同DELLA 蛋白连接，成为GA－GID1－DELLA 三聚体，然后激活泛素26S 蛋白酶降解DELLA 蛋白，解除DELLA 蛋白对生长的抑制作用，进而产生“赤霉素效应”。

Cao等［27］研究表明，DELLA 蛋白反向调控GA信号途径。但是，本试验中DELLA基因表达水平并没有随着内源GA 含量增加而降低。缺铁胁迫同时诱导了梨叶片内源GA 合成和DELLA 蛋白基因的表达，其中的调控机制尚有待进一步深入研究。

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