刘小丹, 董继胜, 姬铁强, 杨培龙

1.黑龙江迪龙制药有限公司, 黑龙江 安达 151400;

2.中国农业科学院饲料研究所, 农业部饲料生物技术重点实验室, 北京 100081

一种来源于Brachybacteriumsp. DB5的α-半乳糖苷酶克隆及性质研究

刘小丹1,2, 董继胜1, 姬铁强1, 杨培龙2*

1.黑龙江迪龙制药有限公司, 黑龙江 安达 151400;

2.中国农业科学院饲料研究所, 农业部饲料生物技术重点实验室, 北京 100081

α-半乳糖苷酶是一种有着巨大商业价值的工业酶制剂，在医药、食品和化工等行业有着广泛的应用。以来源于雪莲根部土壤的短状杆菌Brachybacteriumsp. DB5为材料，从其基因组中扩增出一个α-半乳糖苷酶基因编码序列，经过测序及BLAST比对分析，证实该基因属于α-半乳糖苷酶。将其与pET-30a(+)载体相连后在大肠杆菌中进行异源表达，经过诱导获得了此酶的胞外高效表达，粗酶液的活性为5.07 U/mL，经纯化后酶的活性达72.78 U/mL，酶学特性分析表明其最适pH为6.0，最适温度为40℃。此酶可用作动物饲料豆粕的添加剂，以提高饲料的利用率。

α-半乳糖苷酶;短状杆菌;基因克隆;表达;性质

α-半乳糖苷酶(α-galactosidase，EC3.2.1.22)是一种外切糖苷酶，在动植物、人和微生物体内广泛存在。它可以专一性水解催化多种寡糖、糖脂等非还原性糖链末端的α-半乳糖残基，其中包括人B型血抗原[1]。

通常，在豆类饲料中(如大豆籽实和豆粕中)添加α-半乳糖苷酶，可以减少动物胃肠胀气，提高饲料的利用率[2]。另外，α-半乳糖苷酶在医药、食品和化工行业中也有广泛的应用[3]。在医药行业，α-半乳糖苷酶可用以治疗Fabry疾病[4]。微生物来源的α-半乳糖苷酶具有易控制、高产、价廉等优点，是近年来国内外研究的热点。目前，在多种微生物中都克隆到了α-半乳糖苷酶基因，并已经实现了重组基因的高效表达[5]。

本研究通过对α-半乳糖苷酶核苷酸序列的比较，设计了一对简并引物，利用PCR技术，建立了一种快速筛选α-半乳糖苷酶编码基因的方法。并在原核系统进行表达且对表达产物的酶学性质进行了初步研究，为进一步通过蛋白质定向改造该酶的最适pH、作用温度及酶活性，构建高产α-半乳糖苷酶的基因工程菌株打下坚实基础，以便其产业化推广应用。

1 材料与方法

1.1 材料

短状杆菌(Brachybacteriumsp. DB5)、大肠杆菌(Escherichia.coli)BL21(DE3)、大肠杆菌(E.coli)TOP10、pET-30a(+)载体均为中国农业科学院饲料研究所杨培龙课题组保存或构建[6]。pEASY-T3购自全式金公司。各种限制性内切酶、连接酶和Taq酶购自TaKaRa公司。蜜二糖、棉子糖、水苏糖购自Sigma公司。其余为国产分析纯。引物合成和测序由北京三博远志公司完成。

1.2 方法

1.2.1 α-半乳糖苷酶基因片段的克隆

提取短状杆菌菌株DB5的基因组DNA[7]。根据已分离的α-半乳糖苷酶基因保守区域特点，设计特异性引物：RP4：5′-GAYGAYGGNTGGTTYGGN-3′；RPr8：5′-GACCATYTCNGGYTCNA-MCC-3′。采用TD-PCR程序[8]，扩增基因片段并测序。基因组DNA作为模板进行扩增，体系(50 μL)为:10×Buffer (Mg2+)5 μL,2.5 mmol/L dNTP mix 4 μL,5 U/μLTaqDNA聚合酶0.5 μL,100 μmol/L上、下游引物(上游特异性引物RP4和下游引物RPr8)各1.5 μL, 模板DNA(50 ng/μL)1 μL,ddH2O 36.5 μL。TD-PCR扩增条件：94℃预变性4 min；94℃ 25 min，58～48℃ 25 s，72℃ 1 min，10个循环；然后进入第二个循环程序：94℃ 25 min，48℃ 25 s，72℃ 1 min，20个循环；72℃ 5 min。

1.2.2 α-半乳糖苷酶TAIL-PCR扩增基因全长 根据DB5已获得的α-半乳糖苷酶基因片段，采用Tail-PCR方法获得基因全长[9]，所设计的特异引物见表1。所获得的基因命名为aga-DB5。

1.2.3aga-DB5与表达载体pET-30a(+)连接 插入的基因位点采用EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点，表达引物为：DB5gaU:5′-CAGGAATTCGTGACCGCGCCCCGGCC-3′(划线为EcoRⅠ位点)；DB5gaD:5′-ATAGCGGCCGCTCAGGAGATCGCC-GCAGAGCTG-3′(划线为NotⅠ位点)。将aga-DB5基因克隆到表达载体中，经测序表明克隆正确，与读码框相符，预测蛋白被准确表达。把该重组酶命名为aga-DB5-H。PCR再扩增反应体系(50 μL)为：10×Buffer 5 μL, 2.5 mmol/L dNTP mix 4 μL, 2.5 U/μLTaqDNA聚合酶0.5 μL,20 μmol/L上、下游引物各1 μL,DB5基因组模板(10 ng/μL)1 μL,ddH2O 37.5 μL。反应条件为：95℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 3.5 min，35个循环；72℃延伸10 min。

表1 Tail-PCR引物

1.2.4 重组酶aga-DB5-H的诱导表达和纯化 挑取转化后的阳性菌按常规方法进行摇瓶培养, 当OD600为0.6时，加IPTG使其终浓度为1 mmol/L诱导表达。在12 h取样，粗测酶活为胞外表达，通过膜包和超滤浓缩菌液。利用重组酶融合的6his-tag标签，选择镍柱纯化为纯蛋白。

1.2.5 重组酶aga-DB5-H的SDS-PAGE分析 取1 mL酶液，加入等体积的2×SDS上样缓冲液100℃煮5 min, 取15 μL用于10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳。

1.2.6 pH和温度对重组酶aga-DB5-H的影响 酶活性测定方法采用pNPG法[10]。在37℃，pH 2.0～11.0的条件下，经纯化的重组酶aga-DB5-H进行酶促反应以测定其最适pH，缓冲液为pH 2.0～8.0的0.1 mol/L McIlvaine缓冲液和pH 9.0～11.0的0.1 mol/L甘氨酸-NaOH缓冲液。再将酶液于37℃，pH 2.0～11.0的缓冲液中处理30 min，测定其酶活并研究酶的pH稳定性。最适温度的测定为在最适pH的条件下，温度为0～70℃下进行酶促反应。温度稳定性测定是在不同温度下处理30 min，再进行酶活测定。然后绘制最适曲线。

1.2.7 化学试剂或离子对重组酶aga-DB5-H的影响 在不同的金属离子或化学试剂的酶促反应体系中，使加入物质的终浓度为1 mmol/L或5 mmol/L，在37℃、pH 6.0下，保温30 min，以空白作为对照，研究不同物质对酶活性的影响[11]。

2 结果与分析

2.1 α-半乳糖苷酶基因序列分析

测序结果表明，来源于短状杆菌Brachybacteriumsp. DB5的α-半乳糖苷酶基因，全长2 271 bp，编码756个氨基酸和一个终止密码子。其与基因组测序的BrachybacteriumfaeciumDSM 4810来源的α-半乳糖苷酶基因最高序列相似性为81%。将重组酶命名为aga-DB5-H，其理论分子量为82 kDa。通过BLAST比对，酶蛋白与BrachybacteriumfaeciumDSM 4810的α-半乳糖苷酶 (Genbank accession No.: WP012804378 )存在最高的相似性为77.%。证实其为一种新的GH36家族α-半乳糖苷酶。

2.2 表达产物SDS-PAGE分析

基因转化到大肠杆菌后，诱导表达，其粗酶液的表达效价可达5.07 U/mL，经过镍柱纯化后，纯酶的比活为72.78 U/mL。重组酶经SDS-PAGE得到单一条带，由图1可知，分子量约为82 kDa，与预测分子量相近。蛋白条带经LC-ESI-MS/MS二级质谱分析，结果显示其中3段内肽，F1:RDDTTGLGDW，F2:VSVVLDVTDGR，F3:FRAASAVFG，与蛋白推测序列一致，表明a-半乳糖苷酶基因有效表达。

图1 重组酶aga-DB5-H的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of recombinant aga-DB5-H.

2.3 pH和温度对α-半乳糖苷酶的影响

最适pH、pH稳定性、最适作用温度及热稳定性结果见图2。由图2A可知，该酶的最适作用pH为6.0， pH 3以下和pH 9以上没有检测到酶活；在pH 5.0～10.0的范围内aga-DB5-H能有75%以上的酶活(图2B)，证明其pH稳定性良好。由图2C可知，aga-DB5-H的最适作用温度为40℃，在40℃下处理5min酶活基本不变，处理30 min后还能保持75%以上的活性(图2D)。50℃处理酶活逐渐下降，但总的说来耐热性较好。

图2 pH和温度对重组酶aga-DB5-H活性的影响Fig.2 Effect of pH and temperature on activity of recombinant aga-DB5-H.

2.4 金属离子及化学试剂对重组酶aga-DB5-H的影响

不同浓度的金属离子及化学试剂对重组酶aga-DB5-H酶活的影响结果见表2。从表2中可以看出，金属离子或化学试剂浓度为1mmol/L时，除Ag+、Hg2+和阴性表面活性剂SDS完全抑制aga-DB5-H的酶活外，aga-DB5-H在大部分金属离子和化学试剂中都表现出较好的酶活性。随着溶液浓度的升高，只有EDTA和Pb2+对酶活有不同程度的促进作用，而其他离子和化学试剂在高浓度下则对酶活有不同程度的抑制作用。

2.5 底物降解能力

Aga-DB5-H酶对天然底物的降解能力结果如表3所示，研究发现随着单位酶的增加降解能力增强，蜜二糖在3个单位酶的作用下能够完全降解，其最适底物为蜜二糖。对棉子糖和水苏糖都有一定的水解能力。降解水苏糖的能力比棉籽糖强。因此，分解天然底物的能力为蜜二糖>水苏糖 >棉子糖。

表2 金属离子及相关化学试剂对重组酶aga-DB5-H的影响

表3 Aga-DB5-H对不同底物的降解能力

3 讨论

本研究以PCR的方法成功获得了来源于短状杆菌属微生物的α-半乳糖苷酶基因aga-DB5,并成功地将aga-DB5克隆到pET-30a(+)质粒中，实现了异源高效表达。重组菌经IPTG诱导6 h后的菌液α-半乳糖苷酶活力达到5.07 U/mL，经纯化后酶的活性为72.78 U/mL，提高了13倍。动物饲料豆粕中含有棉籽糖和水苏糖，棉子糖和水苏糖是含 α-半乳糖苷的主要抗营养因子[12]，该酶对天然底物蜜二糖、棉子糖和水苏糖均有降解能力。因此，该酶为一种全新的可以在豆粕中添加的α-半乳糖苷酶，可以提高饲料的利用率，节约养殖成本，增加养殖业的效益。据报道重组α-半乳糖苷酶可有效地将B型红细胞改造成O型红细胞，并且酶解过程是在pH 5～6的情况下进行的，酶解前后都需要改变pH[13]，重组酶aga-DB5-H的最适作用pH为6.0，最稳定的pH范围为5.0～10.0，能保持75%以上的酶活，特别适合将B型红细胞改造成O型红细胞。此酶为B-O血型改造提供了更有效的工具酶。综上可以看出，该重组酶在饲料和医药行业上都有广泛的应用，值得商业开发和利用。

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Studies on the Gene Cloning and its Characterization of α-Galactosidases fromBrachybacteriumsp. DB5

LIU Xiao-dan1,2, DONG Ji-sheng1, JI Tie-qiang1, YANG Pei-long2*

1.HeilongjiangDilongPharmaceuticalCo.Ltd,HeilongjiangAnda151400,China;

2.FeedResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSiences,Beijing100081,China

Alpha- galactosidase is a kind of industrial enzyme preparation with a huge commercial value, which has been widely used in medicine, food and chemical industries. A strain ofBrachybacteriumsp. DB5 was selected to isolate α- galactosidase gene by PCR. Sequencing and BLAST analysises showed that the sequence encoded a α-galactosidase. It was recombinant into the vector pET-30a(+) and transformed into the strainE.coli. α-Galactosidase gene was expressed efficiently after induction with IPTG. An expression activity 5.07 U/mL was obtained. After purification of pure, enzyme activity was 72.78 U/mL. The enzymatic analysis revealed that its optimal pH and temperature were 6.0 and 40℃, respectively. The enzyme could be used for additive of animal feed, soybean meal, in order to improve the feed utilization rate.

α-galactosidase;Brachybacteriumsp.; gene cloning; expression; characterization

2015-02-11; 接受日期：2015-05-01

国家转基因生物新品种培育重大专项(2014ZX08003-002)资助。

刘小丹，工程师，硕士,研究方向为微生物基因工程。E-mail：jinian100@126.com。*通信作者：杨培龙,研究员,博士,博士生导师，主要从事饲料资源与生物技术研究。Tel:010-82106065；E-mail：yangpeilong@caas.cn

10.3969/j.issn.2095-2341.2015.04.10