梁俊仕, 许 雷

中国农业科学院研究生院, 北京 100081

不动杆菌3-苯氧基苯甲酸降解基因的克隆与表达

梁俊仕, 许 雷*

中国农业科学院研究生院, 北京 100081

3-苯氧基苯甲酸(3-PBA)作为拟除虫菊酯类农药的非特异性降解中间产物，具有抗雌激素特性，可扰乱生物体内分泌系统，比菊酯类农药迁移更广，半衰期更长，生物毒性更大，是拟除虫菊酯类农药在生物体中暴露的标志。通过构建4-D菌(Acinetobactersp.)基因组文库，混合池驯化筛选得到4-D菌中降解3-PBA的关键酶基因，其开放阅读框为921 bp,编码306个氨基酸，Genbank登录号为KR024742。经同源比对和酶活验证，证实该酶为邻苯二酚双加氧酶。根据该ORF序列设计引物，引物两端分别加上NdeⅠ和Hind Ⅲ酶切位点，以4-D菌基因组DNA为模板，成功克隆到D34基因序列。构建表达载体pET-21b-D34并转化进宿主大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG(0.1 mmol/L)诱导后，表达重组菌对3-PBA降解率为18.7%。研究结果为3-PBA污染的微生物环境修复提供了理论参考。

不动杆菌；基因组文库；3-苯氧基苯甲酸；原核表达

3-苯氧基苯甲酸(3-phenoxybenzoic acid,3-PBA)是一种常见的各类拟除虫菊酯类农药(在全球范围农业和环境领域广泛应用的杀虫剂，比如氯氰菊酯、溴氰菊酯、氯菊酯、氯氟氰菊酯和苄氯菊酯等)的非特异性代谢中间产物。3-PBA被用作拟除虫菊酯暴露的标志，而且研究证实3-PBA具有抗雌激素的特性，因此普遍认为3-PBA可扰乱生物体内分泌[1]。3-PBA作为各类拟除虫菊酯类农药的代谢中间产物，其半衰期较菊酯类农药更长(180 d)[2]，生物毒性更大[3]。随着传统农业对拟除虫菊酯农药的利用日渐增多，势必对环境造成严重的次级污染。因此，对农药代谢中间产物3-PBA的生物修复研究对于改善农药残留问题，加快环境修复有重要的生态意义。

菊酯类农药降解的第一步是在菊酯解酶的作用下生成3-苯氧基苯甲酸，然后再通过其他的酶系降解3-苯氧基苯甲酸。Maloney等[4]首次报道了降解菌降解氯菊酯的代谢产物3-PBA，推断3-PBA可能的降解途径，3-PBA最终被降解为苯酚和原儿茶酸并且彻底矿化。据之前3-PBA相关的降解研究推测，菌株经过侧面单加氧途径降解3-PBA，但是降解途径不明确，没有测定到降解中间产物。李顺鹏等[5]在研究3-PBA代谢途径的实验中，通过质谱检测发现2个产物分别为3-HBA和邻苯二酚，综合代谢产物鉴定推测出菌株降解3-PBA可能的代谢途径，首先3-PBA在3-苯氧基苯甲酸1,2双加氧酶作用下醚键断裂生成3-HBA和邻苯二酚，中间产物邻苯二酚被继续降解，而3-HBA则不能被降解从而不断积累，反馈抑制降解过程。

目前对3-苯氧基苯甲酸的降解研究比较局限，研究多集中在相关降解菌的筛选和降解条件的优化，没有阐明其主要降解途径及关键降解基因和降解酶，科研应用价值有限。随着拟除虫菊酯农药应用范围的增加以及降解中产物的累积，得到高效降解3-PBA的关键基因，从而构建能高效降解3-PBA的工程菌具有重要的环境修复意义。4-D菌为本实验室前期筛选获得，其可高效降解菊酯农药，且未发现中间产物残留[6]，据此推测其含有降解3-PBA的基因，经验证4-D菌可利用3-PBA作碳源生长。本研究旨在通过基因组文库技术和混合池筛选得到4-D菌中降解3-PBA的关键酶基因，阐明3-PBA的降解途径，从而为构建环境修复工程菌提供可行性论证。

1 材料与方法

1.1 材料

BamHⅠ、Sau3AⅠ、NdeⅠ、HindⅢ、Alkaline Phosphatase、连接酶、dNTPs和Taq酶等均购自Takara公司；基因组提取、质粒提取、胶回收等试剂盒购自OMEGA公司；其他实验仪器及试剂有：DNP-9082型恒温培养箱(上海智诚实验设备有限公司)、摇床(中国科学院武汉科学仪器厂)、DSX-280A高压灭菌锅(上海申安医疗器械厂)、AUX220电子天平(SHIMADZU公司)、 移液枪(Finnpipette公司)、普通台式离心机(德国Heraeus公司)、水平和垂直电泳仪(北京六一仪器厂)、凝胶成像系统(Gene公司)、3-苯氧基苯甲酸(Sigma公司)、IPTG(Sigma公司)、二甲基甲酰胺(MYM公司)、安捷伦1200 series高效液相色谱仪，其他无机和有机试剂均为国产分析纯。

1.2 菌株

大肠杆菌JM109、BL21(DE3)、4-D菌均为本实验室-80℃条件下甘油保存，使用时LB平板划线挑单克隆活化后使用，降解实验前4-D菌株须在以3-PBA作唯一碳源的无机盐培养基中驯化传代培养，使降解基因诱导表达。

1.3 4-D菌基因组文库构建

提取4-D菌基因组DNA，用限制性内切酶Sau3AⅠ部分酶切，梯度试验确定酶切时间与酶量，使酶切后DNA弥散片段集中于2.0～7.0 kb。提取质粒pUC19，BamHⅠ完全酶切。回收线性载体与2.0～7.0 kb的DNA片段，16℃过夜连接后转化大肠杆菌JM109感受态细胞，随机挑选白斑验证基因组文库转化效率。

1.4 混合池驯化筛选目的片段

用LB培养基将所构建文库平板上的白色菌落洗脱，将洗脱的重组子在含氨苄青霉素抗性的液体LB培养基37℃，200 r/min培养2 h，取1 mL 混合菌液于-70℃保存，即为一个混合池，将所构建文库的所有阳性克隆洗脱以混合池的形式短期保存。取1 mL混合池菌液，5 000 r/min离心5 min收集菌体，用基础培养基清洗菌泥，5 000 r/min离心5 min沉淀，重复一次，将清洗过的菌体用基础培养基复溶至OD600=0.6～0.8，3%接菌量至3-PBA筛选培养基(氨苄青霉素抗性)，其中3-PBA终浓度为100 mg/L，37℃，200 r/min培养。根据混合池在3-PBA筛选培养基的生长情况，将生长状况良好的混合池继续以5%接菌量转接至无机盐培养基驯化培养，驯化2～3代后取菌液划线至3-PBA无机盐筛选平板上培养，筛选能够利用3-PBA作唯一碳源的重组子。

提取筛选得到的重组载体，酶切验证后由擎科公司测序，拼接后分析插入片段中的完整开放阅读框(ORF)。对ORF进行Blast比对，确定所得阅读框的同源基因。通过SWISS-MODEL和Predictprotein分析预测氨基酸序列信息和二级结构并构建三级结构模型。

1.5 降解3-PBA关键酶基因克隆与原核表达

根据921 bp的ORF序列设计引物，引物5′端引入NdeⅠ酶切位点，3′端引入HindⅢ酶切位点，引物序列：D34-F：5′-CCCAAGCTTGGGATGAACCGTCAACAAATTGATGCGC-3′，D34-R：5′-GGGAATTCCATATGGAATTCCCTTAAGCACTAGC-GCGACGGCGTTCA-3′，PCR扩增体系：4-D基因组1 μL，PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 0.5 μL，D34-F 0.5 μL，D34-R 0.5 μL，Taq酶0.5 μL，ddH2O 19.5 μL；PCR扩增程序为：94℃，5 min；94℃ 1 min，58℃ 45 s，72℃ 2 min，35个循环；72℃，10 min。克隆得到目的基因D34片段；回收PCR产物，连接T载体转化后筛选阳性重组子；双酶切回收目的基因片段，与表达载体pET-21b连接转化；菌体PCR筛选得到阳性克隆pET-21b-D34，进行菌体PCR和双酶切验证；IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE电泳检测表达产物，并验证重组表达载体降解率[7]以及3-PBA降解酶与芳香族底物的反应特性[8]。

2 结果与分析

2.1 基因组文库构建与重组子筛选

构建基因组文库提取基因组时，应保证基因组DNA长度在50 kb以上。连接体系中的外源片段与载体的摩尔浓度比例是影响连接效率的关键，本实验最佳摩尔浓度比为3∶1。通过酶切梯度实验确定，为得到2～7 kb目的区域的弥散，1 μg基因组DNA的最佳限制性内切酶用量为0.5 U，酶切时间为30 min。如图1所示,2、3泳道为经BamHⅠ完全酶切的线性载体片段，泳道4为基因组部分酶切后的DNA弥散，回收2～7 kb区域的DNA片段作为目的片段与载体连接。

由于降解3-PBA的关键酶基因为诱导基因，且4-D菌在无机盐平板生长菌落较小，基因组文库中功能基因的筛选没有较好的指示条件，实验通过混合池途径筛选已构建好的基因组文库。以3-PBA为底物诱导，逐渐增加3-PBA浓度，成功得到4-D菌基因组文库中降解3-PBA的重组子4-D-3-4单克隆，酶切后的线性重组质粒大小约为4300 bp，插入片段1 600 bp左右。经测序拼接后得到1 636 bp的片段，ORF分析得到921 bp的完整开放阅读框，提交NCBI数据库Blast比对,其与鲍曼不动杆菌邻苯二酚1，2-双加氧酶相似性为99%。暂时命名该核酸序列为D34，Genbank登录号为KR024742。

图1 基因组部分酶切与线性载体电泳图Fig.1 Gel extraction of genomic DNA fragment and plasmid pUC19 digested by restriction enzyme.

2.2 氨基酸结构分析与预测

氨基酸序列长度为306 aa，预测分子量为33 438，Aligned Protein数量为47，PDB结合结构数量为13。二级结构主要含42%的α-螺旋，32%的无规则卷曲，18%的延伸片层和8%的β-转角。运用SWISS-MODEL进行同源建模，D34与不动杆菌2xsr.1.A相似性为92%。SMART分析结果显示D34含有两个结构域，邻苯二酚(氯代邻苯二酚，偏苯三酚)1，2-双加氧酶N端结构域包括23～97位共75个氨基酸残基，参与氧化反应通路和含邻苯二酚化合物的代谢，具有Fe离子结合位点。双加氧酶C端结构域包含101～290位共190个残基，参与氧化反应与细胞内芳香族化合物代谢，具有Fe离子结合能力和催化活性。SEG程序检测到低复杂度氨基酸残基为61～76位(图2,彩图见封三图版)。

2.3 D34原核表达

通过设计引物(5′端引入NdeⅠ酶切位点，3′端引入HindⅢ酶切位点)成功从4-D菌中克隆得到目的基因D34的完整开放阅读框，经系列酶切连接、双酶切和PCR验证后成功构建得到重组表达载体pET-21b-D34。SDS-PAGE电泳检测诱导后的pET-21b-D34表达情况，如图3所示，可见46 kDa左右的产物经诱导后特异性表达。目的条带分子量比预测重组蛋白分子量要大，可能是由于pET-21b自身蛋白共表达，或者是阅读框通读造成诱导表达产物分子量较大，这也是抑制降解酶活性的因素。可在设计特异引物时，在终止密码后加上终止信号，保证完整阅读框的正确表达。芳香族底物反应实验结束后，利用分光光度计测定诱导表达产物与邻苯二酚、对苯二酚和间苯二酚的颜色反应，结果显示pET-21b-D34诱导后表达产物与邻苯二酚有明显的橙黄色反应，与对苯二酚和间苯二酚无明显颜色变化，进一步说明该降解酶的特性，与邻苯二酚双加氧酶相符。

图2 D34编码蛋白三级结构预测图Fig.2 Predictive tertiary structure diagram of D34 encoded protein.(彩图见封三图版)

图3 表达载体SDS-PAGE电泳分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of pET-21b-D34.

如图4所示，经IPTG诱导后构建的重组表达载体pET-21b-D34对3-PBA的降解率为18.7%，而未导入降解基因的对照组不能利用3-PBA作为碳源生长，由于重组菌在3-PBA作唯一碳源的无机盐培养基中生长缓慢，且诱导表达后蛋白活性不高等原因导致表达载体对3-PBA的降解率较低[9,10]。经7 d培养后重组菌OD600仅为0.4左右，可能是由于3-PBA在培养基中溶解度低且次级代谢产物的抑制导致菌体生长缓慢，这也是重组菌对3-PBA利用率较低的原因之一。

图4 pET-21b-D34和对照组对3-PBA的降解情况Fig.4 The degradation rate of 3-PBA by pET-21b-D34 and control.

3 讨论

3.1 3-PBA降解基因的克隆

在基因组DNA提取与保存过程中要避免剪切力等外来机械力作用，切忌反复冻融。对基因组DNA进行部分酶切时要严格确定酶切条件，酶切后的基因组片段过大过小都会影响文库的代表性。构建质粒文库要求大肠杆菌感受态细胞有较高的转化效率，转化步骤需要设置阴性和阳性对照。在基因组DNA文库的扩增中，由于部分单克隆生长较快，随着培养时间延长会导致部分克隆丢失，应严格控制文库培养时间。在转化涂板的过程中，为了减少假阳性或者卫星菌落的过早产生，可在筛选平板上根据所涂菌液的体积加上氨苄青霉素，能够极大提高重组率。

对基因组文库进行功能基因等的筛选，可将冲洗下来的重组菌培养2～3代后摇匀以混合池的形式短期保存，以池为单位进行逐级筛选，可应用于抗性基因筛选、降解底物筛选、分子杂交筛选等，极大地减少了工作量。比如脂肪酶可水解三丁酸甘油酯，可在筛选平板上添加乳化的三丁酸甘油酯作为筛选底物，将每个混合池的菌分别涂布到筛选平板上，根据降解底物产生的透明圈即可得到功能基因克隆。3-PBA降解酶特性未知，因此文库筛选过程没有较好的指示条件，且3-PBA在水中溶解度极小，微生物难以利用，在筛选平板上极难生长。本实验通过混合池途径驯化筛选，以3-PBA为底物诱导，逐渐增加3-PBA浓度，成功得到4-D菌基因组文库中降解3-PBA的重组子4-D-3-4单克隆。

3.2 降解酶基因的原核表达

利用大肠杆菌的原核表达体系具有生长周期短、传代稳定的特点，而且目前关于大肠杆菌遗传表达的研究较为彻底，利用其对真核生物及原核生物功能基因的表达较为快捷，有较为成熟的构建表达体系的流程，尤其是对于构建原核生物基因的表达体系，大肠杆菌表达系统优势明显，较为广泛的用于实验检测乃至商业化生产[10]。然而，大肠杆菌表达系统也有其局限性，很多真核基因编码的蛋白，在合成氨基酸序列后仍需要翻译后加工、修饰形成三、四级结构的功能蛋白才能显示活性，而大肠杆菌表达形成的真核蛋白往往以无活性的包涵体结构形式存在，因此为解决大肠杆菌表达系统的这些问题，对表达载体的构建优化、大肠杆菌的改造以及表达体系优化等方面的研究有效解决了大肠杆菌原核表达体系的局限性[11,12]。本实验通过设计引物(5′端引入NdeⅠ酶切位点，3′端引入HindⅢ酶切位点)成功从4-D菌中克隆得到了目的基因D34的完整开放阅读框，经系列酶切连接和双酶切、PCR验证后成功构建得到重组表达载体pET-21b-D34。芳香族底物实验显示降解酶具有邻苯二酚特征颜色反应，降解实验由于菌体生长较缓慢导致降解率较低，仍需优化培养条件使降解效率提高。

在实际的污染环境中，农药残留多为各种不同类型农药的混合物。为了提高基因工程菌的广谱性，可通过构建共表达载体，将降解多种农药及中间产物的基因进行共表达，从而可同时降解多农药残留。另外，天然降解菌株所产生的降解酶降解性能往往有很大的提升空间。因此，可利用分子生物学的技术手段对降解酶基因进行人为的分子改造，利用定点突变、随机突变等技术构建突变体库，并通过筛选获得降解性能更佳的突变体基因。

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Cloning and Expression of 3-Phenoxybenzoic Acid Biodegrading Gene fromAcinetobactersp.

LIANG Jun-shi, XU Lei*

GraduateSchoolofChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100081,China

3-Phenoxybenzoic acid (3-PBA) is known as non-specific intermediate products of pyrethriods pesticide, which has antiestrogenic activity, and can disturb the endocrine systeminvivo. 3-PBA has wider migration, longer half-life period, and higher biotoxicity than the pyrethroid pesticide, so it has been used as a marker for pyrethroids exposure. With the contruction and screening of 4-D(Acinetobactersp.) genomic library, the key gene having a ORF of 921 bp and encoding an amino acid of 306 aa for degrading 3-PBA was screened, its GenBank accession number was KR024742. Homolog comparison results and substrate experiments inferred that it was catechol dioxygenase. The primer was designed on the authority of opening reading frames(ORF) and added with restriction sites ofNdeⅠ andHindⅢ. With genomic DNA of 4-D as template, the D34 gene was cloned. The recombinant expression vector pET-21b-D34 plasmid was constructed and transformed into competent cell BL21 (DE3). After inducing by IPTG(0.1 mmol/L), the degration rate of 3-PBA was 18.7%. Results provided theory reference for microbial environmental restoration of 3-PBA population.

Acinetobactersp.; genomic library; 3-phenoxybenzoic acid; prokaryotic expression

2015-05-26; 接受日期：2015-06-19

国家863计划项目(2011AA10A205)资助。

梁俊仕，硕士研究生，主要从事微生物分子生物学与基因工程研究。E-mail：liangjunshi1027@126.com。*通信作者：许雷，研究员，主要从事生物化学与分子生物学研究。E-mail：xulei@caas.net.cn。

10.3969/j.issn.2095-2341.2015.04.09