王玻玮， 马方婧， 刘 铭， 桑 伟， 张 巍

(新疆医科大学第一附属医院1病理科， 2乳腺科， 乌鲁木齐 830054)

表阿霉素对乳腺癌细胞系的作用效应

王玻玮1， 马方婧2， 刘 铭1， 桑 伟1， 张 巍1

(新疆医科大学第一附属医院1病理科，2乳腺科， 乌鲁木齐 830054)

目的 探讨表阿霉素对不同乳腺癌细胞系的作用效应。方法 应用流式细胞仪检测并分析表阿霉素作用于乳腺癌细胞系MCF-7、SKBR3、 MDA-MB-231及MDA-MB-468后免疫原性标志物的表达以及不同乳腺癌细胞系死亡过程中免疫原性死亡的能力；采用CCK-8方法观察表阿霉素对不同乳腺癌细胞系增殖的抑制效应。结果 (1)表阿霉素作用于各个乳腺癌细胞系24 h后，MDA-MB-231与MDA-MB-468细胞系的增殖率明显低于MCF-7细胞系的增殖率，差异有统计学意义(P<0.05 )。(2)MDA-MB-231与MDA-MB-468细胞系表阿霉素作用24h的IC50值明显低于MCF-7与SKBR3细胞系。(3) 钙网蛋白、HSP70随着表阿霉素作用时间的增加而增加，24h后MDA-MB-231与MDA-MB-468细胞系中的表达明显高于MCF-7细胞系，差异有统计学意义(P<0.001)。SKBR3细胞系中钙网蛋白、HSP70的表达则稍高于MCF-7细胞系(P>0.05)。结论 表阿霉素的作用效应不仅包括细胞毒性作用，还潜在免疫原性死亡作用过程；激素受体阴性乳腺癌细胞死亡过程中的免疫原性死亡作用较强。

表阿霉素； 乳腺癌； 免疫原性死亡

中国目前是世界乳腺癌发病率增长最快的国家之一。近年来，中国乳腺癌发病率以3 %的速率递增，乳腺癌已成为城市女性死亡之首,在全球其他国家，乳腺癌同样是妇女死亡的重要诱因[1]。化学治疗(化疗)是乳腺癌早期治疗的基石，化疗可以改善淋巴结阴性乳腺癌患者的预后[2-3]。但化疗往往存在严重的毒性反应并且费用昂贵，因此研究化疗耐药的预测因子有很重要的意义。以往认为化疗的主要作用机制是通过诱导肿瘤细胞死亡达到清除肿瘤的目的。蒽环类化疗药物(阿霉素)不仅诱导肿瘤细胞发生死亡，而且可诱导处于死亡过程中的肿瘤细胞表达或释放一些标志物，介导微环境等改变增强死亡中肿瘤细胞的免疫原性，从而促进肿瘤细胞的死亡[4-6]。这些标志物包括细胞膜上的钙网蛋白( calreticulin，CRT) 、MHC I 类分子、分泌型的热休克蛋白( heat shock proteins，HSPs)等[7]。具有这些特征的死亡细胞能被机体免疫细胞，特别是被树突状细胞( dentritic cells，DCs)所摄取，DCs作为功能最强的专职抗原递呈细胞，能够刺激初始型T细胞增殖，从而促进机体免疫系统对肿瘤细胞的攻击[8]。这类能被免疫系统识别并攻击的死亡肿瘤细胞称为肿瘤细胞免疫原性死亡( immunogenic cell death)[9-11]。这些免疫效应可能对化疗疗效有独特的作用，通过研究化疗中肿瘤细胞的免疫原性死亡机制可进一步探索肿瘤传统化疗有机结合免疫治疗的策略，还可能指导化疗疗效的预后评估。

免疫原性细胞死亡是化疗的主要目的之一，免疫原性死亡可促进免疫系统通过“旁路效应”消除化疗耐药细胞及癌症干细胞[12-13]。乳腺癌是一类异质性肿瘤，不同分子分型对化疗的敏感性不同，虽然目前相关的研究众多，但是其机制尚未明确。表阿霉素是目前乳腺癌常用的蒽环类化疗药物之一，其导致乳腺癌细胞免疫原性死亡的研究尚未开展。本研究旨在探讨表阿霉素对不同乳腺癌细胞系的作用效应及诱导免疫原性死亡标志物表达的能力。

1 材料与方法

1.1 抗体及主要试剂藻红蛋白-结合鼠单克隆抗人钙网蛋白抗体购自于R&D公司(IC3898P)，Alexa Fluor®488鼠单克隆 抗人Hsp70抗体购自于Biolegend公司(648004)，表阿霉素(Epirubicin) 购自于Sigma 公司(E9406)，活细胞计数试剂盒(CCK-8)购自日本同仁化学研究所，胎牛血清、DMEM粉状培养基及青霉素-链霉素双抗均购自于美国Gibco公司。

1.2 人乳腺癌细胞系人乳腺癌细胞系MCF7、SKBR3、MDA-MB-231及MDA-MB-468 均购自于美国模式菌种收集中心(American Type Culture Collection， ATCC)。人乳腺癌细胞系MDA-MB-231及MDA-MB-468的细胞特点为雌激素受体(ER)(-)、孕激素受体(PR)(-)、人表皮生长因子受体2(Her-2)(-)，称为三阴性乳腺癌细胞系。人乳腺癌细胞系MCF-7的细胞特点为ER、PR(+)、Her-2(-)，SKBR3细胞特点为ER、PR(-)、Her-2(+)。

1.3 细胞培养将各细胞系均培养于含10%胎牛血清、1×105U/L 青霉素及100 mg/L链霉素的 DMEM完全培养液中。在37℃含5%CO2、饱和湿度的无菌培养箱中培养，每2～3天传代1次，挑选对数生长期细胞进行后续实验。

1.4 CCK-8方法观察表阿霉素对不同乳腺癌细胞系的抑制效应收集对数生长期的乳腺癌细胞，调整细胞浓度为3×104个/mL接种于96孔板，每孔100 μL，置于二氧化碳无菌培养箱中过夜，待细胞长满70%～80%(即对数生长期)时，分别加入药物浓度为172.42、115.52、94.83、86.21、77.59、68.97、60.35、51.73、43.11、34.48、22.93、17.24、11.55、8.62、5.69、4.31、2.88、2.15、1.44、1.078、0.720 μmol/L的表阿霉素。每种浓度设3个复孔，对照组为含细胞不加药物孔，不含细胞及不含药物的完全培养基复孔为调零孔。表阿霉素干预24 h后，吸出旧培养基，每孔加入90 μL新培养基及10 μL CCK-8试剂，置于37℃含5%CO2、饱和湿度的无菌培养箱中培养2 h后酶标仪进行检测。检测各孔在450 nm处的吸光度(optical density, OD)值，计算表阿霉素对不同细胞系增殖率的影响。计算公式如下：细胞活力百分百=(实验组OD值-调零组OD值)/(对照组OD值-调零组OD值)×100%。由药物浓度和相应的增殖率通过GraPh Pad Prism 5.0拟合表阿霉素对细胞系生长增殖曲线，计算出表阿霉素在不同细胞系中24 h的IC50值(本实验后续药物浓度即用此IC50值)。

1.5 流式细胞术检测表阿霉素作用后不同细胞系钙网蛋白及HSP70的表达收集对数生长期的细胞，调整细胞浓度为3×108个/L接种于5 mL培养瓶，每瓶约1.5×106个细胞，置于无菌细胞培养箱中。待细胞贴壁后，分别加入PBS及表阿霉素，使表阿霉素的最终浓度为不同细胞系对应的IC50浓度。24 h后，将贴壁细胞用5 mL含0.02%EDTA的0.25%胰酶消化，并用PBS冲洗2遍。重悬1×106个细胞于500 μL流式固定液中10 min，然后将10 μL的抗体分别加入500 μL细胞悬液中并在室温状态避光孵育30 min。最后以1 000 r/min离心10 min，用PBS清洗1次后置于流式细胞仪，于0、 6、12、 24 h采用流式细胞术检测不同表阿霉素IC50值作用于相应细胞膜表面钙网蛋白及HSP70表达。

1.6 统计学处理采用SPSS18.0软件进行统计分析，计量资料组间比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 表阿霉素对不同乳腺癌细胞系增殖率的影响不同浓度的表阿霉素作用于各个乳腺癌细胞系24h后，MDA-MB-231、MDA-MB-468细胞系的增殖率明显低于MCF-7细胞系的增殖率，差异有统计学意义(P<0.05)。SKBR3细胞系的增殖率低于MCF-7细胞系的增殖率，但差异无统计学意义(P>0.05)。MDA-MB-231、MDA-MB-468、SKBR3与MCF-7细胞系的表阿霉素IC50值分别为8.62、5.69、11.55和34.48μmol/L。MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞系的表阿霉素IC50值明显低于SKBR3与MCF-7细胞系(图1)。

2.2 表阿霉素作用于不同乳腺癌细胞系不同时间钙网蛋白、HSP70的表达钙网蛋白、HSP70随着表阿霉素作用时间的增加而增加，MDA-MB-231与MDA-MB-468细胞系中钙网蛋白与HSP70的表达明显高于MCF-7细胞系。SKBR3细胞系中钙网蛋白与HSP70的表达则稍高于MCF-7细胞系(图 2a～b)。

图1 表阿霉素对不同乳腺癌细胞系增殖的影响

2.3 表阿霉素作用于不同乳腺癌细胞系24 h钙网蛋白及HSP70表达的比较MDA-MB-231、MDA-MB-468及SKBR3细胞系钙网蛋白的表达明显高于MCF-7细胞系，差异有统计学意义(P<0.05)。MDA-MB-231与MDA-MB-468细胞系HSP70的表达明显高于MCF-7细胞系，差异有统计学意义(P<0.05)。SKBR3细胞系HSP70的表达略高于MCF-7细胞系，差异无统计学意义(P>0.05)(图3a～b)。

a:MCF-7钙网蛋白表达b:SKBR3钙网蛋白表达c:MAB-MB-468钙网蛋白表达d:MAB-MB-231钙网蛋白表达

e:MCF-7HSP70表达f:SKBR3HSP70表达g:MAB-MB-468HSP70表达h:MAB-MB-231HSP70表达

图2 表阿霉素作用于不同乳腺癌细胞系不同时间钙网蛋白、HSP70的表达

a: 24 h后钙网蛋白表达 b: 24 h后HSP70表达

图3 表阿霉素作用于不同乳腺癌细胞系24 h钙网蛋白、HSP70的表达

3 讨论

乳腺癌是一种高度异质性恶性肿瘤。目前乳腺癌治疗的首要目标是促进癌细胞死亡，抑制癌细胞生长。最近研究表明细胞死亡具有一定的免疫原性，主要特点是在细胞膜上表达CRT、MHCI 类分子、HSPs及分泌型蛋白HMGB1[5-7]。免疫原性标志物的表达会提高机体对肿瘤细胞的清除作用。目前已知不同分子分型乳腺癌对于化疗药物的敏感性不同，三阴性乳腺癌化疗的缓解率明显高于其他分子分型[2]，但其原理及作用机制尚未阐明。表阿霉素为常用蒽环类化疗药物之一。本研究旨在揭示表阿霉素作用于不同乳腺癌细胞系是否存在免疫原性死亡机制，不同分子分型乳腺癌化疗敏感性是否与此有相关性。免疫原性细胞死亡是化疗的主要目标之一。化疗的主要目的是促进癌细胞的死亡，而免疫原性死亡可促进免疫系统通过“旁路效应”消除化疗耐药细胞和癌症干细胞[12-14]，这些免疫效应可能对化疗疗效有促进或增强作用。研究药物的免疫原性作用机制对于治疗乳腺癌和选择药物敏感性分子分型乳腺癌有重要意义。本研究表明表阿霉素对不同乳腺癌细胞系增殖的影响不同，对激素受体阴性细胞系(MDA-MB-231、MDA-MB-468)的化疗敏感性明显高于激素受体阳性的MCF-7(P<0.05)。并且MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞系的表阿霉素IC50值明显低于其他细胞系，提示激素受体阴性的乳腺癌化疗敏感性高于其他细胞系，此与Ebctc等[2]报道的结果一致。

作为蒽环类化疗药物之一的表阿霉素，其化疗作用中是否存在免疫原性死亡机制，不同分子分型乳腺癌是否对表阿霉素化疗的敏感性不同，其作用原理是否与免疫原性死亡程度不同有关均需回答。本研究进一步检测免疫原型标志物的表达情况，结果提示钙网蛋白、HSP70随着表阿霉素作用时间的增加而增加，在激素受体阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-468中的增长率明显高于SKBR3和MCF-7细胞系；比较表阿霉素作用24h后钙网蛋白和HSP70的表达量发现激素受体阴性乳腺癌细胞系中明显高于激素受体阳性细胞系MCF-7(P<0.001)。结果提示:(1)表阿霉素的作用过程不仅包括细胞毒性作用，还潜在免疫原性死亡作用过程；(2)激素受体阴性乳腺癌细胞死亡过程中的免疫原性死亡作用较强。

本研究仍存在一定的局限性：(1)免疫原性标志物众多，未进行一一检测；(2)基础实验较单薄，需加入动物实验及组织标本实验。后续研究可进一步探索肿瘤传统化疗有机结合免疫治疗的策略，从而指导个体的化疗及疗效的预后评估。

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(本文编辑 周芳)

The effect of Epirubicin on breast cancer cell lines

WANG Bowei1, MA Fangjing2, LIU Ming1, SANG Wei1, ZHANG Wei1

(1DepartmentofPathology,2DepartmentofBreastSurgery,TheFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830054,China)

Objective The effect of Epirubicin on different breast cancer cell lines. Methods The human breast cancer cell lines MCF7, SKBR3, MDA-MB-231 and MDA-MB-468 were treated with Epirubicin respectively, and the markers of immunogenic cell death were detected by flow cytometry; the proliferation of cell was tested by CCK-8 method. Results (1) After treating for 24 h, the proliferation of MDA-MB-231 and MDA-MB-468 was lower than MCF-7 (P<0.005). (2)IC50ofEpirubicintoMDA-MB-231andMDA-MB-468waslowerthanMCF-7andSKBR3. (3)TheamountofcalreticulinandHSP70wasincreasedgraduallywiththetreatmentofEpirubicin;after24hours,thesemarkersofMDA-MB-231andMDA-MB-468weresignificantlyhigherthanthatofMCF-7 (P<0.001).ThebothmarkersofSKBR3werehigherthanthatofMCF-7,butnotsignificantly(P>0.005). Conclusion The effect of Epirubicin not only includes cytotoxic effect, but also potential immunogenicity death process. During the process of cell death, the immunogenicity death effect of hormone receptor negative breast cancer cell is stronger.

epirubicin; breast cancer; immunogenic cell death

新疆维吾尔族自治区自然科学基金(2014211C049)

王玻玮(1981-),男，硕士，主治医师，研究方向：乳腺癌分子病理。

张 巍，女，博士，主任医师，博士生导师，研究方向：乳腺癌分子病理，E-mail: wbw_feng132@126.com。

R

A

1009-5551(2015)12-1520-04

10.3969/j.issn.1009-5551.2015.12.017

2015-01-04]