刘 清， 刘 涛， 郑树涛， 杨晨晨， 王 栋， 戴 芳， 卢晓梅

(1新疆医科大学第一附属医院临床医学研究院， 乌鲁木齐 830054； 2新疆医科大学， 乌鲁木齐 830011)

·民族肿瘤学·

食管癌中ERK1/2的功能及其与EMT的相关性分析

刘 清1， 刘 涛1， 郑树涛1， 杨晨晨2， 王 栋1， 戴 芳1， 卢晓梅1

(1新疆医科大学第一附属医院临床医学研究院， 乌鲁木齐 830054；2新疆医科大学， 乌鲁木齐 830011)

目的 探讨细胞外信号调节激酶(Extracellular Signal-regulated Kinase，ERK1/2)信号通路在食管癌中的功能及其对上皮间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)的调控作用。方法 实验组使用ERK1/2磷酸化抑制剂U0126,抑制ERK1/2的磷酸化程度后，阴性对照组为正常培养的Eca109细胞，采用噻唑蓝实验、细胞划痕以及Transwell实验分别检测ERK1/2对食管癌细胞Eca109增殖、迁移和侵袭的影响，通过Western blot实验检测ERK1/2对EMT相关蛋白Vimentin表达的影响。结果 U0126作用后，食管癌细胞Eca109增殖受到抑制，迁移速度减慢，侵袭细胞数显著减少，同时Vimentin蛋白表达量显著降低。结论 磷酸化的ERK1/2能够促进食管癌细胞的增殖、迁移和侵袭；磷酸化的ERK1/2能够调控Vimentin的表达，食管癌中ERK1/2可能参与了EMT过程，从而促进了食管癌细胞的侵袭和转移。

食管癌； 细胞外信号调节激酶(ERK1/2)；Vimentin； 上皮间质转化(EMT)

新疆是食管癌(Esophageal cancer, EC)高发区[1]，其中哈萨克族人群食管癌发病率远远高于居住于同一地域的维吾尔族和汉族，同时因侵袭和转移导致食管癌患者生存期普遍较短，预后较差。

细胞外信号调节激酶(Extracellular Signal-regulated Kinase，ERK1/2)又称P44/42MAPK，属于MAPK家族，是MAPK通路中的代表激酶[2]。当细胞受外界刺激时，ERK1/2是决定其命运的关键性因素，持续活化的ERK1/2能够促进细胞增殖以及细胞的恶性转化，在包括乳腺癌[3]、肺癌[4]、胃癌[5]的多种人类肿瘤中都可发现ERK1/2的过度激活。

上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)是肿瘤细胞播散和转移重要的内在机制，其主要特征是上皮细胞失去极性并获得间质细胞的特性，上皮细胞失去了细胞与细胞之间正常的结构，E-钙黏蛋白(E-cadherin)等上皮标志物表达受到抑制，细胞之间彼此分离，波形蛋白(Vimentin)、Twist等间质标志分子的表达量增多，细胞获得活动能力并抵抗凋亡，与肿瘤细胞的原位侵袭和远处转移有着密切的关系[6]。Vimentin是分子量为54 ku的III型中间丝蛋白，是构成细胞骨架的重要成分，其表达改变可以影响细胞的多种生物学行为，Vimentin特异性地分布于间充质来源的细胞，在细胞恶变时，可能反常地表达一些上皮源性的细胞，尤其是上皮源肿瘤细胞，即参与EMT的发生。多项研究发现Vimentin与乳腺癌、肝癌、结肠癌、前列腺癌等上皮性恶性肿瘤的侵袭和预后密切相关[7]。

现有研究表明，包括ERK1/2在内的多种信号通路参与EMT过程的调控，同时ERK1/2直接或间接上调Vimentin的表达，从而促进EMT的发生[8]。本研究旨在探讨食管癌中ERK1/2的作用及其对Vimentin表达的调控，初步探讨上皮间质转化对食管癌的调控作用，为进一步深入研究食管癌浸润、转移机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料食管鳞癌细胞株Eca109、EC9706购自武汉大学细胞保藏中心。ERK1/2磷酸化抑制剂U0126购自Invitrigon公司，兔抗人ERK1/2、p-ERK1/2、Vimentin多克隆抗体购自CST公司，兔抗人GAPDH抗体购自Santa Cruz公司，Western blot二抗显色试剂盒购自Invitrigon公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 食管鳞癌细胞系Eca109、EC9706用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液在37℃、5% CO2恒温培养箱中培养。

1.2.2 U0126刺激 按3×105个细胞/孔接种于6孔板，无血清RPMI-1640培养液饥饿12 h，实验组使用ERK磷酸化抑制剂U0126 50 μM/孔刺激细胞，48 h后收集细胞并提取蛋白。以正常培养的Eca109细胞为阴性对照组。

1.2.3 Western blot检测U0126刺激后磷酸化ERK1/2及EMT相关蛋白Vimentin在Eca109细胞中的表达 收集U0126刺激后48 h的细胞，使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。SDS-PAGE电泳并转膜，室温封闭0.5 h，加入ERK1/2(1∶1 000)、p-ERK1/2(1∶1 000)、Vimentin(1∶1 000)以及内参GAPDH(1∶1 000)抗体，4℃摇床孵育过夜后，加入二抗，室温孵育2 h，碱性磷酸酶显色并拍照。

1.2.4 噻唑蓝(MTT)检测U0126刺激后细胞增殖能力 细胞培养及U0126刺激方法同上，按3×104个细胞/孔接种细胞于96孔板。以正常培养的Eca109细胞为阴性对照组。每组设4个复孔。分别于U0126刺激后24、48、72、96 h每孔加MTT(5 mg/mL) 100 μL，37℃、5%CO2恒温培养箱孵育4 h，弃去MTT，每孔加二甲基亚砜(DMSO)150 μL，用酶标仪检测各组细胞490 nm波长处的吸光度。

1.2.5 划痕实验检测U0126刺激后细胞迁移能力 U0126刺激方法同上，按3×105个细胞/孔接种于6孔板，U0126刺激后0 h用10 μL无菌枪头在每孔底部轻划1条直线，于0、24、48、72 h在倒置显微镜下观察划痕宽度并拍照，观察不同组别细胞划痕的愈合速度。

1.2.6 Transwell实验检测U0126刺激后细胞侵袭能力 将有基质胶的Transwell小室放入细胞培养板，上室加入预温后的无血清培养基，37℃孵箱内作用30 min后吸除剩余液体。消化收集U0126刺激48 h后的细胞，无血清RPMI-1640培养液重悬，将细胞密度调整至3×105/孔，将细胞悬液加入小室，下室加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，培养24 h后，擦去上室底部基质胶及未侵袭细胞，固定、并染色，在倒置显微镜下观察、计数。

2 结果

2.1 同细胞系中磷酸化ERK1/2的表达运用Western blot检测2种食管癌细胞系中磷酸化ERK1/2的本底表达后发现，Eca109中磷酸化ERK1/2的表达显著高于Ec9706细胞(图1)。本研究后续均使用Eca109细胞进行U0126刺激后的实验。

图1 Western blot检测食管癌细胞系中磷酸化ERK的本底表达

2.2 ERK1/2对Eca109细胞增殖的影响U0126刺激后48、72、96 h，实验组吸光度较阴性对照组明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

2.3 ERK1/2对Eca109细胞迁移的影响U0126刺激后48、72 h，实验组划痕宽度明显宽于阴性对照组，即实验组划痕的愈合速度减慢，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

与阴性对照组比较， *P<0.05。

2.4 ERK1/2对Eca109细胞侵袭的影响实验组侵袭细胞数[(20±7.3)个]较对照组[(43±6.0)个]明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)(图4)。

与阴性对照组比较, *P<0.05。

与阴性对照组比较, *P<0.05。

2.5 ERK1/2影响上皮间质转化相关蛋白Vimentin的表达U0126刺激作用抑制了磷酸化ERK1/2的表达，同时上皮间质转化相关蛋白Vimentin的表达也受到了明显抑制(图5)。

3 讨论

食管癌严重危害哈萨克民族身体健康，其病程进展快，进展转移是一个极其复杂的调控过程，常导致患者的早期死亡[9]，掌握食管癌的浸润、转移机制对提高患者的生存率显得尤为重要。ERK1/2信号通路的活化在食管癌中呈现上调趋势，激活ERK1/2的级联反应在食管癌的发生和发展中发挥重要作用[10]。U0126是蛋白激酶MEK有效的选择性抑制剂，被广泛用于对ERK信号通路的研究，在非小细胞肺癌中，U0126能够逆转TGF-β1介导的上皮间质转化，并抑制FOXM1基因的表达，也就是说ERK信号通路调控FOXM1表达参与了TGF-β1介导的上皮间质转化过程[4]；减少Erbin基因的表达能够增加ERK的磷酸化，促进TGF-β1诱导的上皮间质转化，包括增加对E-cadherin的抑制，诱导α-肌动蛋白的表达和纤连蛋白的分泌，而U0126的作用能够抑制上述效应的产生[11]。本研究主要通过U0126抑制食管癌细胞Eca109中的ERK信号通路，进而研究ERK1/2的作用及其对Vimentin表达的调控，初步探讨上皮间质转化对食管癌的调控作用。

图5 Western blot检测干扰ERK表达对Vimentin蛋白表达的影响

肿瘤细胞运动、侵袭能力增加，穿透基底膜，侵犯周围组织、血管并转移至远处器官， EMT在这一过程中发挥了重要的作用，EMT过程中间质细胞标志物Vimentin的表达发生显著变化，其表达变化更是与食管癌关系密切：食管癌中Vimentin表达量显著增加，同时Vimentin高表达与食管癌患者的淋巴结转移显著相关[12]；另有研究显示食管癌中Vimentin的表达与血管侵袭以及预后不良显著相关[13]。活化的ERK1/2在EMT介导的肿瘤细胞侵袭、转移过程中也发挥重要的作用：c-Met是肝细胞生长因子(HGF)受体，ERK1/2是c-Met下游重要的调控因子，ERK2能够增强HGF诱导的细胞运动能力，从而促进肿瘤细胞的侵袭和转移[14]；GSK3β的活性受到ERK信号通路的调控，当其活性受到抑制时，Slug的表达增加，E-cadherin的表达受到抑制，即ERK信号通路通过GSK3β间接促进EMT[15]；另有研究报道活化的ERK2能够使Slug蛋白表达增加，间接促进Vimentin蛋白的表达，最终参与肿瘤细胞的侵袭和转移[8]。

本研究发现抑制ERK1/2的磷酸化程度能够抑制食管癌细胞的增殖、迁移和侵袭，间接证明磷酸化的ERK1/2能够促进食管癌细胞的增殖、迁移和侵袭；同时发现，抑制ERK1/2的磷酸化程度后，Vimentin蛋白的表达量显著减少，即磷酸化的ERK1/2能够调控Vimentin的表达，也就是说在食管癌中ERK1/2可能参与了EMT过程，从而促进了食管癌细胞的侵袭和转移，此结果可为进一步阐述食管癌浸润、转移的机制奠定基础，深入探讨EMT相关信号通路对食管癌浸润、转移的调控作用及其机制，对于食管癌预后的研究具有重要意义。

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(本文编辑 杨晨晨)

The association between expression of ERK1/2 and EMT in esophageal squamous cell carcinoma

LIU Qing1, LIU Tao1, ZHENG Shutao1, YANG Chenchen2, WANG Dong1, DAI Fang1, LU Xiaomei1

(1ClinicalMedicalResearchInstitute,theFirstAffliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830054,China;2XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

Objective To investigate the role of extracellular signal-regulated kinase (ERK1/2) and its regulation of epithelial-mesenchymal transition (EMT) in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC). Methods The experiment group was performed using U0126, and the negative control group was normal cultured Eca109 cells. The effective of ERK1/2 on proliferation, migration and invasion of ESCC cell Eca109 were tested by MTT, wound healing and transwell after dephosphorylated ERK1/2. Expression of vimentin was detected by western blot. Results The proliferation of Eca109 cell was inhibited, the rate of migration was slowed down, and the number of invasive cells was significantly reduced after deal with U0126. Meanwhile, the expression of vimentin was significantly reduced. Conclusion Phosphorylated ERK1/2 contributed to the proliferation, migration and invasion of ESCC cells. Phosphorylated ERK1/2 regulated the expression of vimentin, it may be involved in the EMT process, thus contributing to the invasion and metastasis of ESCC.

ESCC； ERK1/2； vimentin； EMT

新疆维吾尔自治区自然科学基金青年基金(2013211B62)

刘 清(1985-)，女，硕士，助理研究员，研究方向：肿瘤分子病理学。

卢晓梅，女，博士，教授，研究员，博士生导师，研究方向：消化道肿瘤的转化医学研究，E-mail：luxiaomei88@163.com。

R34; R655.4

A

1009-5551(2015)12-1482-04

10.3969/j.issn.1009-5551.2015.12.006

2015-08-30]