张春晓，鲁广建，王永亮

·论著·

脑脊液单核细胞早期分泌性抗原靶-6联合脑脊液阿拉伯糖甘露糖脂抗体对结核性脑膜炎的诊断价值研究

张春晓，鲁广建，王永亮

目的 探讨脑脊液单核细胞早期分泌性抗原靶-6(ESAT-6)联合脑脊液阿拉伯糖甘露糖脂(LAM)抗体对结核性脑膜炎的诊断价值。方法 选择2010年1月—2014年8月在新乡医学院第一附属医院住院的结核性脑膜炎患者49例作为结核性脑膜炎组，化脓性脑膜炎患者28例作为化脓性脑膜炎组，病毒性脑膜炎患者24例作为病毒性脑膜炎组，同期体检健康者60例作为正常对照组。各组受检者均进行脑脊液细胞学检查和生化检查，脑脊液单核细胞ESAT-6及LAM抗体检测，并通过绘制ROC曲线评价脑脊液单核细胞ESAT-6、脑脊液LAM抗体及二者联合(并联试验)对结核性脑膜炎的诊断效能。结果 4组受检者脑脊液白细胞计数、中性粒细胞分数、淋巴细胞分数及单核细胞分数比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。4组受检者脑脊液蛋白含量、糖含量、氯化物含量比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。脑脊液单核细胞ESAT-6诊断结核性脑膜炎的曲线下面积(AUC)为0.876〔95%CI(0.764，0.910)〕，取最佳临界值时灵敏度为89.80%、特异度为96.43%；脑脊液LAM抗体诊断结核性脑膜炎的AUC为0.852〔95%CI(0.560，0.890)〕，取最佳临界值时灵敏度为55.10%、特异度为100.00%；两者联合诊断结核性脑膜炎的AUC为0.924〔95%CI(0.850，1.000)〕，取最佳临界值时灵敏度为92.00%、特异度为97.30%。结论 脑脊液单核细胞ESAT-6联合脑脊液LAM抗体对结核性脑膜炎的诊断效能较高，有助于提高诊断结核性脑膜炎的灵敏度。

脑膜炎；结核，脑膜；脑膜炎，病毒性；早期分泌性抗原靶-6；阿拉伯糖甘露糖脂抗体

颅内感染是神经系统常见疾病，近年来其发病率呈明显增高趋势。结核性脑膜炎是颅内感染的一种，主要指由结核杆菌侵犯脑膜或脊髓膜而引起的非化脓性炎性疾病，约占肺外结核的6%[1]。由于结核性脑膜炎临床症状不典型，临床诊断难度较大，若诊断不及时或治疗不当，其病死率及后遗症发生率将明显升高。结核性脑膜炎最客观的临床诊断依据是在脑脊液中发现结核杆菌，但结核性脑膜炎患者脑脊液结核杆菌培养阳性率仅为20%～30%，且通常需要4～6周甚至更长的培养时间，易延误治疗，导致不可逆转的神经功能损伤和病死率增高。因此，寻找特异性好、灵敏度高的结核性脑膜炎早期诊断方法一直是临床上备受关注的问题。

早期分泌性抗原靶-6(ESAT-6)是从结核杆菌中分离纯化出的一种相对分子质量较低的蛋白，具有较好的细胞免疫、体液免疫活性，主要存在于致病性结核杆菌而不是非致病性结核杆菌或卡介苗中，特异性好，可作为结核杆菌的靶抗原之一[2]。阿拉伯糖甘露糖脂(LAM)是构成分枝杆菌细胞壁的特有成分，具有分歧杆菌菌属特异性。由于除结核杆菌之外的其他分枝杆菌引起的中枢神经系统性疾病罕见LAM，因此LAM抗体可作为诊断结核性脑膜炎的特异性指标之一[3]。目前，关于ESAT-6或LAM抗体单独检测在结核性脑膜炎中的诊断价值研究已有较多报道，但关于两者联合检测对结核性脑膜炎的诊断价值研究报道较少。本研究旨在探讨脑脊液单核细胞ESAT-6联合脑脊液LAM抗体对结核性脑膜炎的诊断价值，以期为结核性脑膜炎的早期诊断提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2010年1月—2014年8月在新乡医学院第一附属医院住院的结核性脑膜炎患者49例作为结核性脑膜炎组，非结核性脑膜炎患者52例作为非结核性脑膜炎组，同期体检健康者60例作为正常对照组。结核性脑膜炎组中男23例，女26例；年龄4个月～67岁，中位年龄30岁；入院前均未接受抗结核药物治疗，从发病至入院接受正规抗结核药物(四联抗结核)治疗时间为10～49 d，平均(24.3±5.1)d；单纯结核性脑膜炎32例，合并陈旧性肺结核9例，血型播散性肺结核5例，脊椎结核3例；均行颅脑CT或MRI检查，其中37例发现异常，表现为轻度梗阻性脑积水32例，脑膜、脑基底池明显强化10例，脑肿胀7例，脑梗死1例。非结核性脑膜炎组中男27例，女25例，年龄17～72岁，中位年龄28岁；化脓性脑膜炎28例(化脓性脑膜炎组)，病毒性脑膜炎24例(病毒性脑膜炎组)。正常对照组中男29例，女31例，年龄14～68岁，中位年龄36岁；均以头痛为主诉，但经体格检查未发现神经系统阳性体征，脑脊液及相关实验室检查结果均属正常。

【本文要点】

早期分泌性抗原靶-6(ESAT-6)主要存在于致病性结核杆菌而不是非致病性结核杆菌或卡介苗中，特异性好，可作为结核杆菌的靶抗原之一。阿拉伯糖甘露糖脂(LAM)具有分歧杆菌菌属特异性，LAM抗体可作为诊断结核性脑膜炎的特异性指标之一。脑脊液单核细胞ESAT-6联合LAM抗体对结核性脑膜炎的诊断效能较高，有助于提高诊断结核性脑膜炎的灵敏度。

1.2 诊断标准 结核性脑膜炎：(1)临床表现为发热、头痛或呕吐，存在脑膜刺激征或伴有局灶性神经损伤；(2)脑脊液检查示细胞数增加，蛋白含量增高，糖含量及氯化物降低，阿利新兰染色无隐球菌；(3)颅脑CT或MRI检查发现脑基底池渗出、脑积水或梗死灶；(4)存在颅外结核(如肺结核)；(5)抗结核药物治疗有效[4]；(6)排除其他神经系统疾病。非结核性脑膜炎：参考第6版《神经病学》制定[5]。

1.3 检查方法

1.3.1 脑脊液检查 采用Thermo Fisher公司生产的FCSⅣ型微型脑脊液细胞玻片离心沉淀器，常规制片、保存，进行脑脊液细胞学检查和生化检查。

1.3.2 脑脊液单核细胞ESAT-6检测 取脑脊液1 ml，采用Shandon公司生产的Therm-4 Shandon Cytospin玻片离心机离心，进行免疫荧光染色；将有沉淀细胞的玻片加入10%中性甲醛溶液固定10 min，之后蒸馏水冲洗，0.01 M磷酸盐缓冲液(PBS)浸泡5 min，3% H2O2去离子水孵育10 min以去除内源性过氧化物酶活性；加10%正常山羊血清100 μl，封固，室温条件下置于湿盒内30 min，0.01 M PBS震荡漂洗3次，5 min/次，晾干；加入一抗〔小鼠抗人ESAT-6单克隆抗体(Orbigen公司)〕50 μl，稀释比例为1∶200；以PBS替代一抗作为阴性对照，置于湿盒内37 ℃温箱孵育1 h，4 ℃过夜，取出后37 ℃温箱复温30 min，0.01 M PBS震荡漂洗3次，5 min/次，晾干。避光条件下加入荧光二抗〔异硫氰酸荧光素(FITC)-兔抗鼠多克隆抗体(Orbigen公司)〕50 μl，稀释比例为1∶40，置于湿盒内37 ℃温箱孵育1 h，0.01 M PBS震荡漂洗3次，5 min/次，晾干；加入10%正常山羊血清100 μl，封固，置于湿盒内室温30 min，0.01 M PBS震荡漂洗3次，5 min/次，晾干后立即用95%甘油封固。采用脑脊液图文分析仪(MCDS-2020)采集图像并进行判读，单核细胞胞质呈绿色荧光为阳性，单核细胞胞质呈暗淡浅绿色为阴性。

1.3.3 脑脊液LAM抗体检测 采用间接酶联免疫吸附试验、MycoDotTM试剂盒(Dyna Gen公司)，以提纯LAM为固相抗原，吸附标本内LAM-IgG；取脑脊液200 μl，经抗原梳免疫吸附、洗涤非特异性附着物及金标二抗显色后判读结果，所有操作严格按照试剂盒说明书进行，以试剂盒提供的标准色标为参照判断阳性与阴性结果。

2 结果

2.1 脑脊液细胞学检查结果 结核性脑膜炎组患者脑脊液均呈混合细胞反应，化脓性脑膜炎组患者呈以中性粒细胞为主的混合细胞反应，病毒性脑膜炎组患者呈淋巴样细胞反应，正常对照组受检者脑脊液细胞学检查属正常。4组受检者脑脊液白细胞计数、中性粒细胞分数、淋巴细胞分数及单核细胞分数比较，差异均有统计学意义(P<0.05，见表1)。

2.2 脑脊液生化检查结果 4组受检者脑脊液蛋白含量、糖含量、氯化物含量比较，差异均有统计学意义(P<0.05，见表2)。

2.3 脑脊液单核细胞ESAT-6检测结果 结核性脑膜炎组患者中单核细胞ESAT-6阳性者44例，可见单核细胞胞质呈绿色荧光(见图1A)；阴性者5例，可见单核细胞胞质呈暗淡浅绿色(见图1B)。

2.4 脑脊液LAM抗体检测结果 结核性脑膜炎组患者中脑脊液LAM抗体阳性者27例，阴性者22例。

Table 2 Comparison of cerebrospinal fluid biochemical examination results among the four groups

组别例数蛋白含量(g/L)糖含量(mmol/L)氯化物含量(mmol/L)正常对照组600.21±0.073.47±1.02125.47±7.69结核性脑膜炎组493.45±0.57a1.92±0.47a103.57±9.54a化脓性脑膜炎282.58±0.70ab2.34±0.19ab108.45±10.47ab病毒性脑膜炎240.87±0.14abc3.57±1.06bc126.54±8.66bcF值8.9245.1476.142P值0.0030.0240.038

注：与正常对照组比较，aP<0.01；与结核性脑膜炎组比较，bP<0.05；与化脓性脑膜炎组比较，cP<0.01

注：A单核细胞质呈绿色荧光；B单核细胞胞质呈暗淡浅绿色

图1 结核性脑膜炎患者脑脊液单核细胞ESAT-6免疫荧光染色结果

Figure 1 Immunofluorescence staining results of ESAT-6 of cerebrospinal fluid mononuclear cells of tubercular meningitis patients

表1 4组受检者脑脊液细胞学检查结果比较

注：与正常对照组比较，aP<0.01；与结核性脑膜炎组比较，bP<0.01；与化脓性脑膜炎组比较，cP<0.01；“-”表示无数据，正常对照组、化脓性脑膜炎组、病毒性脑膜炎组受检者脑脊液未见浆细胞表达

2.5 脑脊液单核细胞ESAT-6、脑脊液LAM抗体及二者联合的诊断效能 脑脊液单核细胞ESAT-6诊断结核性脑膜炎的AUC为0.876〔95%CI(0.764，0.910)〕，取最佳临界值时灵敏度为89.80%，特异度为96.43%；脑脊液LAM抗体诊断结核性脑膜炎的AUC为0.852〔95%CI(0.560，0.890)〕，取最佳临界值时灵敏度为55.10%，特异度为100.00%；两者联合诊断结核性脑膜炎的AUC为0.924〔95%CI(0.850，1.000)〕，取最佳临界值时灵敏度为92.00%，特异度为97.30%(见图2)。

图2 脑脊液单核细胞ESAT-6、脑脊液LAM抗体及二者联合诊断结核性脑膜炎的ROC曲线

Figure 2 ROC curve of ESAT-6 of cerebrospinal fluid mononuclear cells，cerebrospinal fluid LAM-IgG and combination of both in diagnosing tubercular meningitis

3 讨论

作为一种慢性传染性疾病，在全球范围内结核感染造成的经济负担较为沉重，结核性脑膜炎是肺外结核中病情较为严重的一种，也是结核感染常见类型，通常在结核感染后3个月～1年内发病。由于结核性脑膜炎临床表现多变，脑脊液检查结果及影像学检查结果缺少特异性表现，因此其临床诊断较困难，特别是早期结核性脑膜炎，有文献报道我国结核性脑膜炎误诊率约为50.73%[6]。自我国大力推广卡介苗接种和广泛展开结核病防治工作以来，结核性脑膜炎发病率明显降低，患者预后取得较大改善，但诊断不及时或治疗不当依然会危及患者生命。传统的结核性脑膜炎诊断方法包括脑脊液细胞学与生化检查、抗酸杆菌检测及结核杆菌培养等，但灵敏度低、检测周期长，易造成医疗资源浪费，难以满足诊断与鉴别诊断结核性脑膜炎的实际需要。因此，探寻结核性脑膜炎的早期诊断方法一直是临床上备受关注的问题。

ESAT-6是一种由结核分枝杆菌早期分泌的含有95个氨基酸的蛋白质，分子量为9.975 kDa，由D1区基因Rv3875编码。正常情况下，单核细胞ESAT-6含量很少，结核分枝杆菌感染时单核细胞ESAT-6含量明显增高[7]，因此检测脑脊液单核细胞ESAT-6含量较检测胞外ESAT-6含量的灵敏度更高，脑脊液单核细胞检出ESAT-6不但提示结核分枝杆菌感染，还可以说明结核分枝杆菌已进入大量繁殖阶段，致病性强。此外，卡介苗及非结核分枝杆菌中均不含ESAT-6，因此，ESAT-6对结核分枝杆菌具有特异性，可作为结核感染的重要特异性抗原靶。Kashyap等[8]通过酶联免疫斑点法在一个昏迷患者病原体鉴定之前检测出其脑脊液中存在ESAT-6抗原特异性淋巴细胞，从而将其确诊为结核性脑膜炎。

作为分枝杆菌属特有的菌壁成分，LAM具有菌属特异性。结核杆菌和麻风杆菌是分枝杆菌属对人类有致病力的主要菌种，而其他杆菌感染人类极少见。由于麻风杆菌所致麻风病已十分罕见，且麻风病常具有特殊临床表现，易于诊断和鉴别诊断，因此可采用LAM及其抗体诊断结核杆菌；此外，由结核分枝杆菌以外的分枝杆菌引发的中枢神经系统疾病少见，故LAM及其抗体可作为结核性脑膜炎的特异性诊断指标，目前临床上已将血清LAM-IgG水平作为诊断结核病的指标之一，有研究表明，通过检测脑脊液LAM抗体诊断结核性脑膜炎的灵敏度更高[3，9]。

本研究结果显示，结核性脑膜炎组患者脑脊液均呈混合细胞反应，这与发病初期中性粒细胞增加为主及继而淋巴细胞大量增加有关[10]；与正常对照组相比，结核性脑膜炎组患者脑脊液蛋白含量增加，糖及氯化物含量减少，这是结核性脑膜炎的典型改变[11-12]。通过绘制ROC曲线发现，脑脊液单核细胞ESAT-6诊断结核性脑膜炎的AUC为0.876，取最佳临界值时灵敏度为89.80%、特异度为96.43%；脑脊液LAM抗体诊断结核性脑膜炎的AUC为0.852，取最佳临界值时灵敏度为55.10%、特异度为100.00%；两者联合诊断结核性脑膜炎的AUC为0.924，取最佳临界值时灵敏度为92.00%、特异度为97.30%，提示脑脊液单核细胞ESAT-6联合脑脊液LAM抗体对结核性脑膜炎的诊断效能较高，有助于提高诊断结核性脑膜炎的灵敏度。免疫荧光染色结果发现，结核性脑膜炎组有5例患者单核细胞胞质呈暗淡浅绿色，究其原因可能是ESAT-6与其他病原存在交叉反应，但具体作用机制仍有待进一步研究。

综上所述，脑脊液单核细胞ESAT-6联合脑脊液LAM抗体对结核性脑膜炎的诊断效能较高，有助于提高诊断结核性脑膜炎的灵敏度，值得临床推广应用。

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(本文编辑：鹿飞飞)

Diagnostic Value of ESAT-6 of CSF Mononuclear Cells Combined with CSF LAM-IgG on Tuberculous Meningitis

ZHANGChun-xiao，LUGuang-jian，WANGYong-liang.

TheFirstDepartmentofTuberculosis，theFirstAffiliatedHospitalofXinxiangMedicalCollege，Xinxiang453100，China

Objective To explore the diagnostic value of ESAT-6 of CSF mononuclear cells combined with CSF LAM-IgG on tuberculous meningitis.Methods From January 2010 to August 2014 in the First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical College，49 inpatients with tuberculous meningitis were selected as A group，28 inpatients with purulent meningitis were selected as B group，24 inpatients with viral meningitis were selected as C group，and 60 healthy cases admitted to the hospital for physical examination were selected as D group.All of the four groups underwent CSF cytology examination，CSF biochemical examination，ESAT-6 of CSF mononuclear cells detection and CSF LAM-IgG detection，ROC curve was drawn to evaluate the diagnostic value of ESAT-6 of CSF mononuclear cells，CSF LAM-IgG and combination of both on diagnosis of tubercular meningitis.Results There were statistically significant differences of WBC，neutrophil percentage,lymphocyte percentage and monocyte percentage of CSF among the four groups(P<0.05).There were statistically significant differences of protein content，sugar content and chloride content of CSF among the four groups(P<0.05).TheAUCof ESAT-6 of CSF mononuclear cells in diagnosing tuberculous meningitis was 0.876〔95%CI(0.764，0.910)〕，the sensitivity was 89.80%，the specificity was 96.43%；theAUCof CSF LAM-IgG in diagnosing tuberculous meningitis was 0.852〔95%CI(0.560，0.890)〕，the sensitivity was 55.10%，the specificity was 100.00%；theAUCof combination of both in diagnosing tuberculous meningitis was 0.924〔95%CI(0.850，1.000)〕，the sensitivity was 92.00%，the specificity was 97.30%.Conclusion Combination of ESAT-6 of CSF mononuclear cells and CSF LAM-IgG has certainly high diagnostic value on tuberculous meningitis，which is helpful to improve the sensitivity.

Meningitis；Tuberculosis，meningeal；Meningitis，viral；Early secreting antigenic target- 6；Anti-lipoarabinomannan antibody

河南省科技厅资助项目(0624410104)

453100河南省新乡市，新乡医学院第一附属医院结核内一科(张春晓，王永亮)；检验科(鲁广建)

王永亮，453100河南省新乡市，新乡医学院第一附属医院结核内一科；E-mail：yangzi2105@126.com

R 529.3

A

10.3969/j.issn.1008-5971.2015.07.004

2015-04-20；

2015-07-15)

张春晓，鲁广建，王永亮.脑脊液单核细胞早期分泌性抗原靶-6联合脑脊液阿拉伯糖甘露糖脂抗体对结核性脑膜炎的诊断价值研究[J].实用心脑肺血管病杂志，2015，23(7)：15-19.[www.syxnf.net]

Zhang CX，Lu GJ，Wang YL.Diagnostic value of ESAT-6 of CSF mononuclear cells combined with CSF LAM-IgG on tuberculous meningitis[J].Practical Journal of Cardiac Cerebral Pneumal and Vascular Disease，2015，23(7)：15-19.