黄艳君，罗 勇，张中念，曹飞虎，董 明，宋晓灵，张弟文

(1.四川省绵阳市第三人民医院神经内科，四川 绵阳 621000；2.重庆医科大学附属第一医院神经内科，重庆 400016；3.重庆市神经病学重点实验室，重庆 400016)

电刺激小脑顶核对大鼠局灶脑缺血/再灌注后脑内脑源性神经营养因子mRNA的影响

黄艳君1，罗 勇2，张中念1，曹飞虎1，董 明1，宋晓灵1，张弟文1

(1.四川省绵阳市第三人民医院神经内科，四川 绵阳 621000；2.重庆医科大学附属第一医院神经内科，重庆 400016；3.重庆市神经病学重点实验室，重庆 400016)

目的 探讨电刺激小脑顶核(fastigial nucleus stimulation，FNS)对受损脑组织功能重建的作用。方法 将180只雄性Wistar大鼠随机分为正常组(NC组)、假手术组(SC组)、模型组(I/R组)和小脑顶核假刺激组(I/RFs组)、小脑顶核刺激组(I/RF组)各36只。采用线栓法制备大鼠右侧大脑中动脉局灶脑缺血/再灌注模型。应用原位杂交法检测随缺血再灌注后1、3、7、14、21、28天各组侧脑室和海马脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor，(BDNF)mRNA表达。结果 光镜下正常脑组织侧脑室和海马区域BDNF mRNA阳性反应较弱，局灶脑缺血/再灌注后I/R组缺血侧纹状体内BDNF mRNA表达增加(P< 0.05)，7天达一小高峰(P< 0.01)，14天后迅速下降(P< 0.01)；而缺血/再灌注后再予FNS，I/RF组BDNF mRNA阳性表达明显增加(P< 0.01)，7天达到高峰(P< 0.01)，在海马且BDNF mRNA阳性反应染色更深，部分神经元可见长的突起，状如蝌蚪，维持到14天，然后逐渐缓慢下降，21天时仍明显高于其余各组(P< 0.01)，28天时仍明显高于正常水平(P< 0.01)。结论 FNS能持续上调BDNF mRNA的表达，使其表达更高，高峰延迟。FNS对脑缺血具有较持久的脑保护作用。

电刺激小脑顶核；局灶脑缺血/再灌注；神经营养因子；大鼠

小脑顶核(fastigial nucleus，FN)是位于第四脑室顶小脑白质内的四对核团之一，有学者认为，FN由肾上腺素能的固有神经元及过路神经纤维所构成，电刺激小脑顶核(fastigial nucleus stimulation，FNS)能激发其固有神经元，导致血压升高、血管反射性扩张及脑血流增加，并由此引出了“条件性中枢神经源性神经保护(conditioned central neurogenic neuroprotection，CCNN)”的概念[1]。神经营养因子与中枢神经系统的恢复密切相关，对神经再生、神经元迁移、轴突的发芽、延长和成束以及神经环路的正确形成起着重要作用。本研究观察了局灶脑缺血再灌注大鼠脑内脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)mRNA的动态变化以及FNS后的动态变化，探讨FNS对受损脑组织功能重建的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 选取健康雄性的Wistar大鼠180只，清洁级，8周龄，体质量250～300 g，由重庆医科大学实验动物中心提供。将大鼠随机分为正常组(NC组)、假手术组(SC组)、模型组(I/R组)、小脑顶核假刺激组(I/RFs组)和小脑顶核刺激组(I/RF组)各36只，每组根据再灌注时间的不同又分为1、3、7、14、21和28d 6个时间点进行观察(n=6)。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂与仪器 针对大鼠BDNF靶基因的mRNA序列的寡核甘酸探针序列：5′-CTTAC TATGG TTATT TCATA CTTTG GTTGC-3′；5v-GCTGA GCGTG TGTGA CAGTA TTAGT GAGTG-3′；5′-ACACT TCTTG TGTAT GTACA TTGAC CATTA-3′(探针由武汉博士德生物技术有限公司设计合成并用地高辛标记)。原位杂交试剂盒和原位杂交专用盖玻片(武汉博士德)，DAB显色剂(北京中山)；DEPC和Poly-L-Lysine[Sigma(USA)]，立体定位仪，SEN 3301型方波脉冲电子刺激器(日本光电公司)；电动恒流泵(上海精科实业有限公司)。

1.2.2 局灶脑缺血/再灌注模型制备 根据Longa等[2]报道的方法，参照罗勇等[3]的经验，采用线栓法制备右侧大脑中动脉局灶脑缺血再灌注模型。栓塞成功的大鼠缺血1 h，再次麻醉，拔出线栓至颈外动脉残端内，实现再灌注。模型成功标准：左侧肢体疼痛回缩迟钝或消失，提尾倒悬时左上肢向胸前屈曲，行走时向左侧倾倒或向左转圈；右侧出现霍纳(Honer’s)氏征。排除标准：神经功能评分低于2分者，蛛网膜下腔出血者，HE染色无缺血病理改变者，未到观察时相点便死亡者。凡因上述因素导致各实验组动物数不足预定数量者采用随机抽样原则补齐。

1.2.3 干预方法 大鼠术前12 h禁食不禁水，均于缺血后1 h行再灌注，并于再灌注后立即刺激左侧小脑顶核1 h。I/RF组大鼠给予电刺激小脑顶核：大鼠用3.5%水合氯醛腹腔注射(1 ml/100 g)麻醉，固定于立体定向仪上，根据Wistar大鼠脑立体定向图谱[4，5]，结合鼠的大小确定左侧小脑顶核定位，以前囟后缘为零点，正中线向后11.4～11.8 mm，旁开0.8～1.0 mm，深5.2～5.7 mm。于左侧颅骨上钻1个孔，将方波脉冲电子刺激器的同心圆电极插入左侧小脑顶核(病灶对侧)进行刺激。刺激参数：电流强度为50 μA、频率为50～100 Hz、时程为0.5 ms的直角方波脉冲。刺激时间：于再灌注后立即给予电刺激，持续时间1 h。I/RFs组操作同I/RF组，电极插入小脑顶核但不通电流刺激，只留针1 h。I/R组制备脑缺血再灌注模型，不给予电刺激。SC组分离颈外动脉并结扎远端，线栓插入颈内动脉但不栓塞大脑中动脉，不给予电刺激。NC组不造模也不给予电刺激。于脑缺血再灌注后1、3、7、14、21和28 d，经左心室常规灌注固定，开颅取脑，由前向后作冠状切片，取经侧脑室脑组织块各1块，行固定、脱水、浸蜡、包埋、石蜡切片(片厚4 μm)。取材部位：侧脑室(A-P坐标，bregma-0.30至bregma-1.2 mm)，海马(A-P坐标，bregma-4.5至bregma-3.14 mm)。

1.3 图像分析 切片在统一放大倍数(×200)下，随机选择10个非重叠视野，以缺血侧侧脑室为观察部位，每个时相点6只动物，每只动物的每个部位随机取5张非连续切片，应用重庆医科大学电镜室北航CM-2000B型生物医学图像分析系统进行自动计算平均阳性细胞数。

1.4 神经功能评分 参照Zea Longa 5分制评分标准[3]：0分，无神经功能缺失症状；1分，轻度局灶性神经功能缺失(不能完全伸展左侧前肢)；2分，中度局灶性神经功能缺失(向左侧转圈)；3分，中度局灶性神经功能缺失(向左侧倾倒)；4分，不能自发行走，意识水平降低。所有动物于脑缺血再灌注后1、6、12 h及1、3、7 d进行评定。

1.5 统计学方法 采用SAS 8.2统计学软件进行数据处理。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析及q检验。P< 0.05为差异有统计学意义，P< 0.01为差异有显著的统计学意义。

2 结果

2.1 神经症状学评分 大鼠脑缺血/再灌注1 h后均出现神经功能缺损，各组间神经功能评分比较差异无统计学意义(P= 0.6699)；其他时间点I/R组和I/RFS组比较差异无统计学意义(P> 0.05)，I/RF组低于I/R组和I/RFS组，差异有统计学意义(P< 0.05，P< 0.01)，见表1。

表1 大鼠局灶脑缺血/再灌注后神经功能评分比较 (分)

与I/R组和I/RFs组比较：#P< 0.05，*P< 0.01

2.2 侧脑室纹状体区BDNF mRNA的表达水平

NC组纹状体区域BDNF mRNA阳性反应较弱，与SC组比较差异无统计学意义(P> 0.05)。I/R组局灶脑缺血/再灌注后1 d，缺血侧纹状体内BDNF mRNA表达增加，3 d明显增加，7 d达高峰，14 d下降，21 d明显下降，28 d时下降到略高于正常水平(P< 0.05，P< 0.01)。I/RFS组与I/R组差异无统计学意义(P> 0.05)。缺血/再灌注后再予FNS，I/RF组BDNF mRNA阳性表达明显增加(P< 0.01)，3 d时增加更明显，7 d达到高峰，维持到14 d，然后逐渐缓慢下降，21 d时仍明显高于其余各组(P< 0.01)，28 d时明显下降，略高于I/R组和I/RFS组(P< 0.05)，明显高于正常水平(P< 0.01)，见表2。

2.3 海马区BDNF mRNA的表达水平 局灶脑缺血/再灌注后，I/R组缺血侧海马BDNF mRNA表达增加，1 d时即有增多，3 d达到高峰，7 d迅速下降(P< 0.01)；I/RFS组与I/R组变化相似，差异无统计学意义(P> 0.05)。缺血/再灌注后再予FNS，I/RF组BDNF mRNA阳性表达明显增加，7 d时达到高峰，14 d逐渐下降(P< 0.01)，21 d进一步下降(P< 0.05)，28 d仍明显高于正常水平(P< 0.01)，见表3。

3 讨论

神经营养因子是神经系统重要的生物活性因子，对神经系统的正常分化、发育、成熟、维持功能和存活、损伤修复等均具有重要的生物学作用。BDNF参与缺血性脑损伤的保护过程，BDNF能减少缺血引起的梗死面积，保护半影区神经元，并能抑制迟发性神经元坏死[4]。

表2 各实验组纹状体区BDNF mRNA的表达水平(光密度)

与NC组和SC组比较：#P< 0.05，*P< 0.01；与I/R组和I/RFs组比较：*P< 0.05，▲P< 0.01

表3 各实验组海马区BDNF mRNA的表达水平(光密度)

与NC组和SC组比较：#P< 0.05，*P< 0.01；与I/R组和I/RFs组比较：*P< 0.05，▲P< 0.01

研究发现，FNS是高等动物机体内存在一种固有的自身保护机制，受内外环境刺激后被激活，可产生较广泛、持久的神经保护作用[5，6]。动物实验表明，FNS后大脑皮质局部脑血流(rCBF)的增加可达对照组的300%，而不伴脑组织糖代谢率的改变[7]；FNS 1 h，可使脑梗死体积缩小约50%，产生的脑保护作用可持续10 d以上；其缩小脑梗死体积的效果是特异性的，刺激其他脑区则不能减轻脑缺血损害[8～16]。

本实验观察到，在正常脑组织中，BDNF mRNA表达广泛，但阳性反应很弱。局灶脑缺血/再灌注后3 d，BDNF mRNA在缺血侧海马和大脑皮质可达一小高峰，而FNS后BDNF mRNA阳性反应更加强烈，7 d时才达高峰，一直维持到14 d，然后缓慢下降。研究发现[17]，BDNF mRNA及其受体TrkB在靶神经元变性区域特异性上调，其上调发生在前3 w，即细胞迁移、分化及整合阶段，且在锥体神经元进行性凋亡的时期上调尤为明显，表明BDNF可能参与并影响了脑损伤后神经干细胞的增殖、分化和移行。这与我们的研究结果一致。更重要的是，BDNF mRNA在正常脑组织纹状体中表达很少，但却在FNS后大量表达，表达时程也较长，一直持续到缺血后28 d仍高于正常组。因临床上对缺血性脑血管病患者的治疗是长期的，BDNF又是一种不能通过血脑屏障的蛋白质，所以，通过“非药物”手段增加内源性BDNF的合成和释放，可避免给予外源性BDNF所带来的各种困难，说明FNS更具有广泛的应用价值和临床意义。

本实验证明，局灶缺血/再灌注后神经干细胞发生增殖、迁移，同时BDNF mRNA也在一定时间内表达上调，再给予FNS后的这种变化更加明显，提示FNS促进了脑内细胞分泌一定数量内源性BDNF，抑制神经元的凋亡，改善了脑内神经元生存环境而促进神经元再生修复。既往研究证实，FNS可抑制谷氨酸的释放，抑制海马CA1区迟发性神经元坏死及半暗带区神经元丧失[18，19]，增加血管内皮生长因子表达，促进脑缺血后毛细血管新生[20，21]，抑制梗死皮质和海马NgR mRNA及其相关蛋白，促进轴突生长[21]。本实验初步显示，FNS后可明显改善局灶脑缺血再灌注后的神经功能缺损程度，可能与其保持了侧脑室区域较高水平的BDNF mRNA表达有密切关系。研究表明，脑缺血后神经营养因子可在一定时间内表达上调，而神经营养因子又是神经干细胞增殖、迁移、分化、网络化的重要因素。FNS可能通过以上途径抑制了脑缺血过程中神经细胞凋亡，有利于细胞存活，改善了神经功能，但其确切的分子机制有待进一步研究。

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Effect of electrical stimulating to fastigial nucleus on brain derived neurotrophic factor in brain of adult rat after focal cerebral ischemia/reperfusion

HUANG Yan-jun，LUO Yong，ZHANG Zhong-nian，CAO Fei-hu，DONG Ming，SONG Xiao-ling，ZHANG Di-wen

四川省卫生厅科研基金资助项目(编号：080211)；重庆市科委攻关项目(编号：2003-7)；重庆市卫生局科研基金资助项目(编号：2005-2-179)

R743.31

B

1672-6170(2015)06-0024-04

2015-03-09；

2015-07-05)