葡萄糖酸钠酶法生产工艺研究

2015-06-20王道会武玉民张云鹏

中国酿造 2015年9期

王道会，武玉民，张云鹏*，刘玲

（1.青岛科技大学化工学院，山东青岛 266042；2.青岛琅琊台集团股份有限公司，山东青岛 266400）

葡萄糖酸钠又名五羟基己酸钠，分子式为C6H11O7Na[1]。由于无毒、热稳定性好等特点，在建筑工业、食品、医药等方面有着广泛的应用[2-4]。其传统的生产方式主要有黑曲霉生物发酵法、多相催化氧化法、电解氧化法等[5-7]。随着生物技术的不断发展，利用酶法生产葡萄糖酸钠已经成为可能，并且更具先进性。酶法生产工艺主要是利用葡萄糖氧化酶[8-9]和过氧化氢酶直接将葡萄糖底物转化为葡萄糖酸，经中和制得葡萄糖酸盐系列产品。此方法具有不需要菌种、不受各种辅料浓度影响[10-11]、节省能源、工艺简化、操作方便、底物浓度高且纯度好、便于提取精制等特点。

本实验利用葡萄糖氧化酶及过氧化氢酶生产葡萄糖酸钠，通过实验探讨了最佳的工艺条件，并与黑曲霉发酵法在发酵时间、产品质量等方面进行对比，为葡萄糖酸系列产品的生产探索一条新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

葡萄糖（工业级）：西王集团有限公司；葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD），酶活力10 000 U/g、过氧化氢酶（catalase，CAT），酶活力60 000 U/g：天津诺维信酶制剂公司；302#活性炭：溧阳市华东活性炭有限公司；酵母浸粉：安琪酵母股份有限公司；尿素：山东省宁津县化工有限公司。

1.2 仪器与设备

FZ33-FZ-Q-5L5L全自动发酵罐：西华仪科技有限公司；RE-201D旋转蒸发器：上海鹰迪设备有限公司；FE20pH计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄糖酸钠合成原理[12]

1.3.2 合成方法

将葡萄糖溶解于水配制成3 L质量分数为35%的葡萄糖浆，调节pH至5.5，加入葡萄糖氧化酶3～5 mL/g（以葡萄糖质量的1%计），搅拌均匀后加入过氧化氢酶2～5 mL/g（以葡萄糖质量的0.75%计），调节葡萄糖氧化酶及过氧化氢酶的添加量，反应温度及反应时间等以探究最优的葡糖氧化酶及过氧化氢酶的反应条件。

1.3.3 葡萄糖氧化酶及过氧化氢酶反应条件优化

反应温度实验：控制相同的反应初糖含量33%，在酶添加量、罐压、风量、搅拌转速保持一致的情况下，测定25℃、28℃、32℃、35℃、40℃条件下20 h的残糖含量。

搅拌转速实验：控制相同的反应初糖含量33%，在酶添加量、风量、罐压、反应时间一致的情况下，测定100r/min、130 r/min、160 r/min、190 r/min、220 r/min条件下20 h时的残糖含量。

风量实验：控制相同的反应初糖含量33%，在酶添加量、罐压、搅拌转速、反应时间一致的情况下，测定1 200 m3/h、1400m3/h、1600m3/h、1800m3/h条件下20h时的残糖含量。

酶添加量优化：控制相同的反应初糖含量33%，在罐压、通风量、转速、反应时间保持一致的情况下，调节发酵葡萄糖氧化酶与过氧化氢酶的添加量，测定最终残糖含量。

1.3.4 黑曲霉发酵法生产葡萄糖酸钠

黑曲霉发酵法所用发酵配方为葡萄糖350 g/L，酵母浸粉0.25g/L，尿素2g/L，pH6.0。在温度31℃，风量1600m3/h，转速220 r/min条件下进行发酵，待发酵残糖降至0.7 g/100 mL后结束发酵，并同酶法发酵法进行比较。

1.3.5 残糖测定方法

按照参考文献[13]的方法进行。

1.3.6 酶法及发酵法葡萄糖酸钠提取实验及比较

对发酵液进行处理，取酶法与发酵法生产发酵液各2 L，分别调pH值，均调至6.6～7.2。将调好pH值的发酵液分别添加4.6 g 302#活性炭，水浴升温至60～70℃保温脱色40 min，过滤。对比发酵液的脱色率及过滤时间。按照参考文献[14]的方法测定溶液脱色率。对脱色清液进行浓缩，浓缩至起晶，过滤，得滤饼用蒸馏水洗涤后放于烘箱中烘干。对晶体进行称量分析，对比晶体质量。按照参考文献[15]的方法测定葡萄糖酸钠的质量。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖氧化酶及过氧化氢酶反应条件优化

2.1.1 反应温度对酶法残糖含量的影响

表1 反应温度对残糖含量的影响Table 1 Effect of reaction temperature on residual sugar content

通过表1可以看出，在25～32℃时，残糖含量随着温度的升高而逐渐降低，但当温度＞32℃时，残糖含量随着温度升高而升高，而且在不同温度条件下残糖含量差别较大，32℃时残糖含量最低。这是因为上述两种酶是蛋白质，蛋白质对反应温度特别敏感，温度升高会加快反应速度，但是随着温度的继续增加，酶活会有所降低甚至被灭活；温度过低，酶的活性受到抑制，反应速度同样会降低。因此最适反应温度为32℃。

2.1.2 搅拌转速对残糖降解的影响

表2 搅拌转速对残糖含量的影响Table 2 Effect of stirring speed on residual sugar content

通过表2可以看出，在100～220 r/min时，增加转速残糖含量逐渐减少，在190～220 r/min时残糖降低不明显，随着转速继续增加，残糖含量反而呈上升趋势，这可能是由于随着搅拌转速的增加，酶与糖液接触频繁，反应速率增快，但继续增加搅拌转速对酶造成一定的破坏，残糖含量降低，考虑成本及残糖降解效果，选择搅拌转速190 r/min为宜。

2.1.3 通风量对残糖含量的影响

表3 通风量对残糖含量的影响Table 3 Effect of air volume on residual sugar content

通过表3可以看出，随着通风量的不断升高，残糖含量呈降低趋势，但是风量从1 600 m3/h升至1 800 m3/h时，残糖降解速率不明显，这是因为随着风量的提高，酶与糖液的接触更加频繁，增加了单位时间的接触面，但当风量再高时，酶与糖液的接触面积已经不能再提高，使残糖降解速率不再增加。考虑成本因素，控制风量在1 600 m3/h即可。

2.1.4 酶添加量对残糖降解的影响

表4 葡糖氧化酶添加量对残糖含量的影响Table 4 Effect of GOD addition on residual sugar content

通过表4可以看出，在固定过氧化氢酶添加量为3 mL/g的情况下，随着葡萄糖氧化酶含量的增加，残糖含量降低，但是在4 mL/g时已经达到饱和，再增加对最终残糖含量的降低不明显。因此固定葡萄糖氧化酶4 mL/g，调节过氧化氢酶的含量。

在固定葡萄糖氧化酶添加量为4 mL/g的情况下，随着过氧化氢酶含量的增加，残糖含量降低，但是在3 mL/g时已达到饱和，完成催化作用，再增加对最终残糖降低不明显。通过表4和表5，最终选择葡萄糖氧化酶添加量为4 mL/g，过氧化氢酶添加量在3 mL/g。

2.2 酶法与发酵法生产葡萄糖酸钠的对比

2.2.1 生产周期及最终发酵残糖的对比

图1 酶法和生物法对发酵时间及残糖含量的影响Fig.1 Effect of enzyme and fermentation method on fermentation time and residual sugar content

通过图1可以看出，随着发酵时间的延长，发酵法与酶法的发酵液残糖含量都降低，但是酶法的反应时间更快，发酵周期更短。这可能是由于酶法直接与培养液接触，直接催化反应的发生，而微生物法则需要由微生物生长并产酶，需要一定的时间，所以发酵进程前期较缓，中期速度较快，在10～18 h达到最高峰，后期则因菌种老化死亡，发酵变缓。酶法较发酵法生产周期上要缩短5～8 h的时间，这样可以节省大量的能耗，同时还可以省去菌种培养以及实验室等辅助生产设施。

2.2.2 酶法与发酵法发酵液脱色效果及过滤时间对比