夏敬胜，蔡瑜

(武汉市第三医院药学部，武汉 430060)

葛根川芎药对中葛根素和阿魏酸的大鼠在体肠吸收机制

夏敬胜，蔡瑜

(武汉市第三医院药学部，武汉 430060)

目的 探讨葛根川芎药对中指标性成分葛根素、阿魏酸在体肠吸收机制，为其复方的研发及临床应用提供依据。方法 采用大鼠在体肠单向灌流法，高效液相色谱(HPLC)法测定葛根素、阿魏酸2种成分含量，考察葛根-川芎药对提取物三种人工肠液缓冲液浓度、灌流时间及大鼠十二指肠、空肠、回肠及结肠对其吸收的影响。 结果 高、中、低浓度葛根-川芎药对中葛根素和阿魏酸的全肠段吸收速率常数(Ka)均约0.01 min-1；两种成分的全肠段表观吸收系数(Papp)均在0.03～0.05 cm·min-1，浓度对葛根素、阿魏酸肠吸收情况影响不大。葛根素在不同肠段的Ka及Papp不同，Ka值在十二指肠最大为(0.099 0±0.002 7) min-1，Papp值在空肠最大为(0.014 0±0.001 2 )cm·min-1；阿魏酸Ka值在十二指肠最大为(0.180±0.036)min-1，Papp值在空肠最大(0.037±0.015)cm·min-1。葛根素的Ka和Papp随时间影响很小，而阿魏酸Ka和Papp都随时间影响变化较大。结论 葛根川芎药对中指标性成分葛根素、阿魏酸属于被动吸收。

葛根素；阿魏酸；药对；吸收，肠，在体

中药药动学研究方法多效仿西药研究模式，从中药材中分离目标成分后，采用生物医学方法研究其吸收、分布、代谢、排泄规律[1]。药物被吸收是发挥药效的首要环节，药物吸收的研究是评价药物生物利用度的重要手段，可为药物的转运及转化研究提供基础。口服药物的吸收，取决于药物本身的理化性质、小肠上皮细胞的通透作用、肠黏膜构造、肠内酶及肠上皮细胞对药物代谢的屏障作用。研究肠吸收机制，可以获得药物在肠道的吸收动力学参数、有效吸收部位、吸收机制、影响因素等信息，从而为提高药物生物利用度提供参考。

在体肠灌流模型的原理是假定药物的减少等于药物的吸收，通过测定灌流液中药物减少量来评价药物的小肠吸收情况，测定吸收速率及吸收量等，计算药物的吸收动力学参数，如药物吸收速率常数(Ka)、表观吸收系数(Papp)等，能在一定程度上反映药物的渗透和吸收动力学特征。可用于研究中药单体成分、复方提取物及中药制剂指标性成分的肠吸收机制，考察胃肠吸收的最适pH和最佳吸收部位[2-4]。

葛根川芎配伍(1.2：1)药对能显著改善脑缺血、眩晕等症状[5-6]，主要用于治疗颈椎病[7]，其药动学研究笔者未见报道。笔者在本实验采用大鼠在体肠单向灌流法，用高效液相色谱(HPLC)法测定葛根川芎药对中指标性成分葛根素、阿魏酸含量，考察不同药物浓度、灌流时间、不同肠段对其吸收的影响。探讨葛根川芎药对中2种指标性成分的在体肠吸收机制，以期为这一药对在复方配伍及临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级斯泼累格·多雷(Sprague Dawley,SD)大鼠，体质量180～220 g，雌雄各半，购自广东省动物实验中心，动物生产许可证号：SCXK(粤)2014-0035，饲养环境SPF级，动物质量合格证号：44008200003485，动物使用许可证号：SYXK(粤)2008-0085。

1.2 试药 阿魏酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110773-201012，纯度：97%)；葛根素对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110752-200912，纯度：98%)；人工肠液(Kreb-Ringer's，KR)缓冲液[8](氯化钙 0.37 g·L-1，葡萄糖1.4 g·L-1，氯化钠7.8 g·L-1，氯化钙0.35 g·L-1，碳酸氢钠1.37 g·L-1，磷酸二氢钠0.32 g·L-1，氯化镁0.02 g·L-1)；乙腈(HPLC级，Honeywell Burdick & Jackson，批号：M44A1H)；甲醇(HPLC级，Honeywell Burdick & Jackson，批号：N5AG1H)；水为纯化水；其余试剂均为分析纯；葛根(产地：广西，批号：110510)、川芎(产地：四川，批号：110510)药材均购自广州致信中药饮片有限公司，经武汉市第三医院药学部陈永刚副教授鉴定为合格药材，均符合《中华人民共和国药典》2010年版相关药材项检验标准，饮片标本保存于武汉市第三医院药学部标本室。

1.3 仪器 戴安Ultimate 3000型高效液相色谱仪(包括四元泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器、Chromeleon工作站)；AR224CN电子天平[d=0.000 1 g，奥豪斯仪器(上海)公司]；SK3300LH超声仪(托利多仪器上海有限公司)；IKA RV10 HB10 basic旋转蒸发仪(德国IKA)；HHS-4S水浴锅(上海宜昌仪器纱筛厂)；TGL-16G高速离心机(上海安亭科学仪器厂)；HL-2恒流泵(上海沪西分析仪器厂有限公司)。

1.4 色谱条件 色谱柱：戴安公司Acclaim C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-乙腈-0.5%磷酸梯度洗脱，洗脱程序见表1。流速：1.0 mL·min-1，检测波长：250 nm，柱温30 ℃。

表1 甲醇-乙腈-0.5%磷酸梯度洗脱程序%

1.5 对照品溶液的配制 分别取阿魏酸、葛根素对照品适量，精密称定，置100 mL量瓶，加甲醇溶解并定容，摇匀，分别得浓度为22 μg·mL-1阿魏酸、27 μg·mL-1葛根素对照品溶液。

1.6 样品溶液的制备 按12：10取葛根、川芎药材1份，加10倍量65%乙醇，回流提取2次，每次2 h，过滤，合并滤液，减压浓缩至无醇味，至95 ℃烘箱中干燥至干，取出，置于干燥器中冷却，打成细粉，备用。取上述葛根川芎药对提取物粉末约25.0，12.5，6.25 g，精密称定，置500 mL量瓶，用KR缓冲液溶解，并稀释至刻度，摇匀，配成高(50 mg·mL-1)、中(25 mg·mL-1)、低(12.5 mg·mL-1)3种浓度。

1.7 大鼠在体肠吸收实验方法 参照文献[2]。将大鼠禁食过夜(自由饮水)，用3 mg·mL-1戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(30 mg·kg-1)，固定。置40 ℃水浴锅上保持体温。沿腹腔中线打开腹腔，分离出所需肠段，于切口处插管(进、出液口插管约3 cm)，结扎。用预热的37 ℃KR缓冲液以150 r·min-1[r为灌流肠段横截面半径(cm)]恒定流速将小肠内容物冲洗干净，再平衡10 min，排净空气，将伤口用脱脂棉覆盖保湿，各组灌流液保持37 ℃恒温，以150 r·min-1速度平衡10 min后，记为0 min时，以后葛根-川芎汤灌流液以100 r·min-1的流速灌流120 min。分别于20，40，60，80，100，120 min用已知质量的离心管收集灌流液，称定质量，再于各管中取灌流液1 mL，加入甲醇1 mL沉淀蛋白，6 000 r·min-1离心5 min，取上清液用孔径0.22 μm微孔滤膜过滤，取滤液即为样品溶液，分别吸取对照品溶液、样品溶液各20 μL注入液相色谱仪，测定各时间点各成分的吸收峰面积。用上述实验方法分别考察高、中、低浓度及各肠段对各成分在体肠吸收的影响规律。

1.8 不同浓度药物在全肠段吸收情况考察 参照文献[2]，考察样品在大鼠十二指肠、空肠、回肠以及结肠中的吸收情况。观察肠段取约10 cm，各肠段区间如下：十二指肠段，自幽门1 cm处开始往下10 cm；空肠，自幽门15 cm处起往下10 cm；回肠，自盲肠上行20 cm处开始往下10 cm；结肠，从盲肠后端开始往下10 cm。不同肠段分别用同一浓度药物的灌流液进行灌流，其他步骤同“1.7” 项，计算样品在各肠段的Ka与Papp，比较药物在不同肠段吸收情况差异[2]。

Qin和Qout分别为肠道进出口灌流液的体积(mL)(假定进出口灌流液密度为110 g·mL-1)，Cin和Cout分别为肠道进出口灌流液的浓度(未知成分按峰面积计算)，l和r分别为被灌流肠段长度(cm) 和横截面半径(cm)，Q为灌流速度，t为灌流时间。Ka和Papp为各个时间段样品的平均值。

2 结果

2.1 线性关系 阿魏酸在8.80～880 ng 范围内线性关系良好，标准曲线为Y=0.018 6X+0.000 5，r=0.999 9；葛根素在1.08 ～108 ng范围内线性关系良好，标准曲线为Y=0.023 6X+ 0.000 6，r=0.999 9。

2.2 精密度实验 精密吸取葛根素、阿魏酸对照品溶液40 μL，连续进样6次，记录葛根素、阿魏酸色谱峰峰面积，计算峰面积积分值RSD值。结果葛根素、阿魏酸RSD分别为0.40%，0.6%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.3 稳定性实验 取高浓度葛根-川芎-KR样品溶液分别于0，12，20，32，40，48 h进样15 μL分析，测定葛根素和阿魏酸峰面积，计算RSD值。结果葛根素、阿魏酸峰面积积分值RSD分别为1.1%，1.3%(n=6)，表明供试品溶液在48 h内稳定。

2.4 重复性实验 取葛根川芎粉末6份，精密称定，按样品制备方法，制备成高浓度样品溶液，按上述色谱条件，进样15 μL分析，记录葛根素和阿魏酸色谱峰峰面积，计算葛根素和阿魏酸的峰面积积分值RSD值。结果RSD分别为3.6%，2.4%，表明方法重复性良好。

2.5 浓度对药物吸收的影响 实验分高、中、低组，每组4只大鼠，雌雄各半，按“1.8” 项方法进行实验。实验结果选取葛根素、阿魏酸，研究其肠道吸收情况。结果见表2,3。

2.6 不同肠段对药物吸收的效果 实验选用中浓度样品溶液按“1.8”项下方法对大鼠4个肠段分别进行灌肠，检测葛根素和阿魏酸的吸收情况。其中每个肠段用大鼠4只，雌雄各半。结果见表4。不同时段各成分吸收情况见图1和图2。

2.7 不同时段各成分吸收情况 不同时段葛根素和阿魏酸Ka和Papp变化趋势见图1，2。

表2 不同浓度动物净水流量

3 讨论

目前关于中药有效成分小肠吸收研究，黄酮类和生物碱类成分最多，醌类、萜类和苯丙素类均有研究[9]。改变口服给药剂型，可以制成脂质体，可增加亲水性中药成分的肠道吸收；或者添加促吸收剂，如葵酸钠、冰片，也可以促进肠道的吸收[10]。

本实验结果显示葛根素和阿魏酸在全肠段均有吸收。用浓度或峰面积计算葛根素和阿魏酸的Ka及Papp值差异无统计学意义。从3种浓度灌流液对大鼠全肠段进行的灌流实验结果可见，药物浓度对各成分吸收参数的影响不大，全肠段的平均吸收量较低，Papp均<0.03。其中葛根素和阿魏酸在全肠段的吸收速率和吸收量差异无统计学意义，浓度对两者影响不大；葛根素在十二指肠吸收最快，在回肠吸收最慢也最少，在空肠吸收最多；阿魏酸在十二指肠吸收最快，在结肠吸收最慢，在空肠吸收量最大，在十二指肠吸收量最小。葛根素的吸收速率和吸收量受时间影响很小，而阿魏酸的吸收速率和吸收量受时间影响变化较大，其中吸收速率随时间先变快，后变慢，而吸收量也先变大，后变小。

表3 不同浓度药物中葛根素和阿魏酸全肠段Ka和Papp值

表4 不同肠段葛根素和阿魏酸的Ka和Papp值

图1 葛根素和阿魏酸Ka随时间变化曲线

图2 葛根素和阿魏酸Papp随时间变化曲线

相关研究结果显示，阿魏酸在全肠段吸收速率差异无统计学意义，且药材中阿魏酸比单体阿魏酸的肠道吸收速率更快[11]。阿魏酸浓度在20～200 μg·mL-1范围内，Ka变化不大，在十二指肠、空肠和回肠的吸收较好，在结肠的吸收较差[12]。复方配伍时，阿魏酸肠吸收量增加，但药物浓度增大时，阿魏酸的肠吸收基本无变化。研究显示，复方配伍后，随着药物浓度增大，葛根素肠吸收增加；其肠吸收量也随浓度增大而增加，属于被动吸收[13]。葛根素在肠道内的吸收表现为一级动力学过程，吸收机制是被动扩散，吸收速率较慢[14-15]。研究显示葛根素与盐酸小檗碱配伍，在肠道内吸收程度和速度随着盐酸小檗碱剂量的提高而升高[16]。加入白芷提取物后，葛根素在空肠吸收明显增加，在空肠灌流实验中，葛根素Papp与Ka随药物浓度增大而逐渐减少，含有P-糖蛋白抑制剂维拉帕米的葛根素Ka与Papp都比单纯葛根素吸收增加2倍多[17]。

从本实验结果可见本药对大鼠的肠吸收情况良好，提示可进一步对不同比例药对配伍和与不同药味组方后的药动学研究，以期为其临床应用提供更可靠实验依据。

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2014-05-10

2014-06-19

夏敬胜(1974-)，男，湖北武汉人，主管药师，从事医院制剂研究。电话：(0)13329703680，E-mail：461981818@qq.com。

蔡瑜(1975-)，男，湖北武汉人，主管药师，学士，主要从事医院制剂研究。E-mail： 920462684@qq.com。

R286；R965

A

1004-0781(2015)02-0173-04

DOI 10.3870/yydb.2015.02.008