林 静，酉鹏华，程 功，王 毅，陈海潮，杨 征，郭 敏

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一种慢性炎症性疾病［1］。CD4＋CD25＋调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）是一类具有负向调节功能的T细胞亚群。研究证实，Treg具有抗AS作用。AS患者循环与AS模型动物Treg数量显著减少，功能明显受损［2］；体内诱导和过继转输Treg均可明显抑制apoE－／－小鼠动脉粥样硬化斑块的发生［3，4］。进一步研究证实Treg抗AS的机制与其内皮保护及抗巨噬细胞泡沫化有关［5，6］，但是Treg是否对AS斑块细胞死亡有影响目前尚无研究。本实验以小鼠巨噬细胞为研究对象，观察Treg对小鼠巨噬细胞死亡的影响，并对其可能机制进行探讨。

1 材料与方法

1.1 实验动物 C57B小鼠，SPF级，购自中国科学院上海实验动物中心，雌雄不限，8周～12周龄。

1.2 主要试剂 淋巴细胞分离液购自上海试剂二厂。小鼠CD4＋CD25＋T细胞磁珠分离试剂盒，MiDiMACS、分选器，LD和MS分选柱购自德国Miltenyi Biotec公司；抗小鼠CD3单克隆抗体为BD Pharmingen公司产品；RPMI1640及胎牛血清为Gibco公司产品。Cyto－Tox 96细胞毒性检测试剂盒购自Promega公司。TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购自Roche公司。Calcein／EthDⅢ染色试剂盒购自Biotium公司。小鼠白细胞介素 （IL）－18、IL－β1ELISA 试 剂 盒 购 自 eBiosience 公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞分离与培养

1.3.1.1 CD4＋CD25＋T细胞及CD4＋CD25－T细胞的分离 断颈处死小鼠，取脾脏，Ficoll分离获得单个核细胞；通过小鼠CD4＋T细胞磁珠分离试剂盒，阴性选择获得CD4＋T细胞；加入PE标记抗小鼠CD25单克隆抗体，再加入磁珠标记抗PE，阳性选择获得CD4＋CD25＋T细胞，阴性选择获得CD4＋CD25－T细胞，通过流式细胞仪（BD FACS Calibur）分析细胞纯度。

1.3.1.2 巨噬细胞的分离 断颈处死小鼠，75%乙醇浸泡10 min，剖腹收集腹腔内液，800 r／min离心5 min后收集细胞，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液调整细胞浓度至1×106／mL，加入培养板中，置5%CO2、37℃孵箱培养4 h后去上清液，用PBS洗去未贴壁细胞。……