王继华等

摘 要 采用稀释涂板法，对小水榕茎部的内生菌进行分离、纯化及16S rDNA鉴定，通过同源性比对构建系统发育树。结果表明：分离到的24株内生菌分别属于5个类群（Alphaproteobacteria、Gammaproteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes、Filimonas）的11个属（Phenylobacterium、Rhizobium、Caulobacter、Sphingobium、Paenibacillus、Staphylococcus、Bacillus、Pseudomona、Chitinophaga sancti、Filimonas、Agrobacterium），其中Alphaproteobacteria、Firmicutes为优势种群，占总数的45.8%；所有菌株与其同源菌株的相似性均在98% 以上。本研究有助于揭示小水榕茎部内生菌的多样性，为发掘其应用潜力提供参考资料。

关键词 植物内生菌 ；小水榕 ；16S rDNA

分类号 S567.3

Abstract A total of 24 isolates of Endophytic bacteria from the inside of the stem of Anubias barteri was isolated by spread-plate method. These isolates were aligned by using the sequences of 16S rDNA and then the phylogenetic tree was constructed. The result showed that 24 isolates belong to 11 genus（Phenylobacterium， Rhizobium， Caulobacter， Sphingobium， Paenibacillus， Staphylococcus， Bacillus， Pseudomona， Chitinophaga sancti， Filimonas， Agrobacterium） of 5 groups（Alphaproteobacteria， Gammaproteobacteria， Firmicutes， Bacteroidetes， Filimonas）. The identity of all isolates were more than 98% same as the sequence of bacteria's in NCBI and 45.8% of them were Firmicutes that were dominant species. The result was beneficial for further study of the diversity of endophytic bacteria in Anubias barteri's stem.

Keywords endophytic bacteria ； Anubias barteri ； 16S rDNA

植物内生菌是指一切生活在植物组织和器官内部但不引起外在症状的真菌、细菌和放线菌等，包括内共生微生物以及潜伏在宿主体内的病原菌和菌根菌[1]。现已证实，大部分植物（例如水稻、甘蔗、番茄、石斛、红豆杉和桉树等）均含有内生菌[2]。植物种类和生长环境等不同都会导致内生菌的种类和数量有所差异，同一种植物在不同的组织部位和生长阶段，其内生菌的多样性不同，表现出一定的宿主专化性和地域专化性[3-4]。目前发现的内生细菌已超过129种，分别属于54个属。这些内生细菌多为土壤微生物种类，其中假单胞菌属、芽孢杆菌属、肠杆菌属以及土壤杆菌属为常见的属[5]。内生真菌大多数属于子囊菌类及其无性型， 包括核菌纲（Pyrenomyete）、盘菌纲（Discomyetes）和腔菌纲（Loculoascomyete）的许多种类；而内生放线菌主要是丝状放线菌、链霉菌属[6-7] 。大多数内生菌通过产生次生代谢物质，如植物生长素、赤霉素、吲哚乙酸等以及通过生物固氮均可促进植物生长[8-10]。内生菌可以通过产生抗生素、酶来直接抑制或降解病原菌，也可以通过诱导植物产生防御性物质（如酚类、醌类物质等），并在细胞间隙中积累该类物质来阻挡病原菌入侵[11-12]。内生菌所产生的一些包括生物碱在内的毒素可致使植食昆虫拒食、体重减轻、生长发育受到抑制甚至死亡[13]。有些内生菌能合成医用抗癌物质，如从多种红豆杉属植物中可分离到能够合成紫杉醇类化合物的内生菌[14]。内生菌有可能成为农业上防治作物病虫害的绿色有效资源和医用抗生素和抗癌药物的新来源。因此，研究植物内生菌的多样性和开发其生物学功能具有十分重要的意义[15]。

小水榕（Anubias barteri）原产于非洲西部，主要分布在以喀麦隆为中心的西非地区，属于天南星科榕叶属水草类沉水植物。叶形与榕树的叶子相似，呈倒卵形，肉穗花序为黄色，叶形佛焰苞，也能在水中开花。生长极为缓慢，叶色常绿，是一种极具观赏价值的优良水草， 作为中前景草在水族箱中应用广泛，市场销售量大，目前已作为一种经济植物在中国华南地区被大量种植[16]。由于长期在水中生长，小水榕的内生菌非常丰富，这也给通过组织培养获得无菌外植体带来困难[17]。关于小水榕的研究相对落后，在内生菌方面的研究还未见报道。本研究通过对小水榕茎部内生细菌的分离以及16S rDNA分子鉴定，探讨小水榕茎部内生细菌的多样性，为分析影响小水榕组织培养的因素和了解其在生长过程中与寄主间的互作关系奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

以小水榕（Anubias barteri）为试验材料，种植于广东省广州市芳芳水榕培育场。于2014年12月选取生长正常、无病虫害的小水榕茎部进行内生菌的分离。

1.2 方法

1.2.1 内生菌的分离及培养

（1）切取近根部1～2 cm的小水榕茎段，剪去叶片和叶柄，先用自来水冲洗30 min，将茎表面冲洗干净；（2）用无菌滤纸吸干茎表面的水滴，再分别用75%酒精浸泡1 min和0.1%升汞浸泡3 min进行消毒，之后用灭菌水冲洗4～5次，每次3 min，用灭菌滤纸吸干；（3）取100 μL最后一次冲洗过的无菌水直接接种在NA培养基上，将其作为对照检验茎段表面消毒的效果；（4）将灭菌后的茎段放进盛有50 μL无菌水的研钵，用研棒挤压小水榕茎段汁液，并用移液器将其收集至1.5 mL离心管中；（5）用无菌的0.01 mol/L磷酸缓冲液（PBS）将茎段汁进行梯度稀释（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7倍）后，各取100 μL涂布于NA培养基上， 于28℃培养3 d后进一步挑取单菌落划线纯化，共分离纯化2～3次；（6）用25%的甘油将其保存于-80℃冰箱备用[18]。

1.2.2 内生菌16S rDNA扩增及测序

采用水煮法提取细菌DNA。挑取纯化后的单菌落于1.5 mL离心管中，加入20 μL无菌水，加热煮沸10 min，离心后的上清液即为DNA溶液，再取1～2 μL作为PCR 模板进行16S rDNA片段扩增，扩增引物为27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′） 和1492R （5′-GGCTACCTTGTTACGACT T-3′）。扩增条件：94℃ 3 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 100 s，共35个循环；72 ℃ 5 min。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，对特异的PCR产物进行测序，采用引物27F和1492R双向测序，之后进行拼接，最后得到16S rDNA序列。

1.2.3 内生菌16S rDNA 序列测定及同源性比对

（1）获得各菌株16S rDNA序列后，分别与GenBank 数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中的已知序列进行BLAST比对分析，寻找具有较高同源性的16S rDNA序列，确定其种类。（2）用Clustal X 对内生菌的序列进行比对，再用Mega 6进行系统发育分析[19]。

2 结果与分析

2.1 小水榕茎部内生菌的分离纯化

于28℃培养2～3 d后，对照培养基上无明显菌落长出，表明试验材料表面已被消毒彻底。而在涂布茎段汁的培养基上出现明显的形态各异的菌落，表明小水榕茎部存在着种类丰富的大量内生菌。经过2～3次的进一步分离纯化，按照菌落形态特征进行筛选，最终共获得24株不同的内生菌（表1），部分内生菌菌落形态见图1。

2.2 16S rDNA序列扩增鉴定及系统发育分析

对所获得的内生菌16S rDNA序列进行扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测，得到大小为1.5 kb左右的特异条带，与预期大小相符（图2）。将PCR产物回收、测序，去掉低质量碱基后，rDNA长度在1.3～1.5 kb。

将所获得的内生菌16S rDNA片段序列与NCBI中的已知序列进行BLAST比对，结果显示大部分菌株16S rDNA序列与已知序列的同源性达到98%以上（表2）。24株内生菌共分为5个类群，分别为阿尔法变形菌（Alphaproteobacteria）、伽玛变形菌（Gammaproteobacteria）、厚壁菌（Firmicutes）、拟杆菌（Bacteroidetes）、腐浆细菌（Filimonas sp.），共计11个属。其中，阿尔法变形菌类和厚壁菌类为优势种群，占总数的45.8%（图3）。分离得到的8个菌株（SR-3、SR-5、SR-6、 SR-8、SR-12、SR-15、SR-27、SR-29）分别属于阿尔法变形菌类的5个属（Phenylobacterium、Rhizobium、Caulobacter、Sphingobium、Agrobacterium）；11个菌株（SR-1、SR-2、SR-7、SR-10、SR-16、SR-17、SR-19、SR-20、SR-25、SR-26、SR-28）分别属于厚壁菌类的3个属（Paenibacillus、Staphylococcus、Bacillus）；关于伽玛变形菌类分离到一个属（Pseudomonas）的3个菌株（SR-4、SR-14、SR-23）；关于拟杆菌类分离到一个属（Chitinophaga sancti）的一个菌株（SR-21）；腐浆细菌（Filimonas）未有明确的生物学分类。系统发育分析结果见图4。

3 讨论与结论

植物内生菌在促进植物生长、开发绿色环保的抗病虫剂和抗癌物质等方面有着巨大的应用潜力和研究价值[20-21]。同时，内生菌与植物的互利共生关系、内生菌群体之间及内生菌与植物之间的动态平衡也是研究的热点[22-24]。小水榕是一种水生植物，研究结果表明，其茎部内生菌类型丰富。分离得到的24株内生菌分别属于5个类群的11个属，其中阿尔法变形菌（Alphaproteobacteria）和厚壁菌（Firmicutes）为优势种群。在生产上为满足市场对种苗的需求，小水榕的快速繁殖主要依靠植物组织培养技术，但其内生菌带来的污染十分严重，导致组培苗成活率较低。小水榕的快繁多以茎段侧芽为外植体，而内生菌的存在是影响组织培养的一个重要因素，导致组培苗生产中污染率高、成苗困难、生产成本增加。在种植中也发现脱毒的小水榕组培苗生长速率明显快于多年生长的老苗，这可能是因为老苗长期生长在一个相对稳定的环境中，温度、水分、光照等对其影响较小，也可能是因为小水榕茎部中的内生菌种类相对较多[25]。因此，有必要进一步了解小水榕内生菌的种类、功能及其与宿主的关系，以便进行更深入的研究。

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