康少平，李永升，刘淑艳，李 萍，魏亚伟

(1.河北北方学院医学检验学院，河北 张家口 075000；2.河北省张家口市第二医院骨外科，河北 张家口 075000；3.河北北方学院 基础医学院，河北 张家口 075000)

人骨髓间充质干细胞培养、鉴定及成骨细胞诱导分化

康少平1，李永升2，刘淑艳1，李 萍1，魏亚伟3

(1.河北北方学院医学检验学院，河北 张家口 075000；2.河北省张家口市第二医院骨外科，河北 张家口 075000；3.河北北方学院 基础医学院，河北 张家口 075000)

目的 建立成人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMSCs)体外分离、培养、鉴定及向成骨细胞诱导分化的方法。方法 骨髓标本取自医院股骨颈骨折手术患者，结合密度梯度离心法和贴壁筛选法分离纯化hBMSCs,倒置显微镜及流式细胞仪对细胞形态及表型进行鉴定。扩增到第三代的细胞应用成骨细胞诱导分化培养基培养，碱性磷酸酶及茜素红染色鉴定。结果 细胞原代培养96 h后，镜下观察细胞呈长梭型、多角型贴壁生长；接种8 d后细胞呈漩涡状排列。经流式细胞术鉴定细胞表面标志物CD44、CD73阳性，CD34、CD45阴性。第三代细胞成骨诱导14 d后，经碱性磷酸酶染色细胞胞质中可见浅蓝色至棕黑色细小颗粒；成骨诱导21 d后，经茜素红染色可见红色钙结节。结论 通过密度梯度离心及贴壁筛选相结合的方法能够分离培养出较高纯度的hBMSCs，在体外具有向成骨细胞分化的潜能,可能作为骨组织工程理想的种子细胞来源。

骨髓间充质干细胞；成骨细胞；诱导；分化

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是一种具有自我更新及多向分化能力的非造血多能干细胞,在不同诱导条件下，成人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)可以分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞及神经细胞等多种类型的组织细胞[1]。但hBMSCs在骨髓中含量极少，仅占骨髓中有核细胞的0.001%～0.01%,因此，体外分离、获得高纯度的hBMSCs尤为重要。我们拟建立一套优化的体外分离培养、扩增和成骨诱导分化体系，通过维持其增殖能力在体外对其进行原代和传代培养，以获得纯度较高的hBMSCs；通过体外定向诱导hBMSCs向成骨细胞分化，为骨组织工程研究提供理想的种子细胞。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料 成人骨髓标本取自医院股骨颈骨折手术患者1例，无血液系统疾病和家族遗传病史。采集标本前经医院伦理委员会批准并征得患者知情同意。

1.1.2 细胞培养试剂 胎牛血清(FBS)，DMEM/F-12培养基，青霉素-链霉素(双抗)，0.25%胰蛋白酶-EDTA，购自Gibco公司。人外周血淋巴细胞分离液(Percoll，1.077 g·mL-1，天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)。

1.1.3 成骨诱导分化试剂及染色试剂 地塞米松，β-甘油磷酸，抗坏血酸；茜素红染液，碱性磷酸酶染色试剂盒，购自Sigma公司。

1.2 实验方法

1.2.1 hBMSCs的分离培养与扩增 5 mL骨髓血标本(肝素抗凝)轻轻混匀与等量DMEM/F-12混合，1 000 r·min-1离心10 min；弃上清及脂肪层，DMEM/F-12重悬细胞，以等体积比缓慢沿管壁叠加在Percoll(1.077 g·mL-1)液面上,2 000 r·min-1离心25 min；吸取乳白色环状细胞层即单个核细胞层，0.1 mol PBS洗涤两次，1 000 r·min-1离心10 min；细胞培养基(10%FBS，DMEM/F-12，1%双抗)重悬细胞，混匀后以1×106/mL接种至6孔板中，镜下观察细胞分布均匀；放置于CO2细胞培养箱中(37 ℃，5% CO2)常氧下进行培养，48 h更换新鲜培养液，去除未贴壁细胞；以后每隔3 d换液一次，待贴壁细胞达到80%～90%融合后，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，以1∶3的比例传代培养，镜下观察细胞形态。

1.2.2 hBMSCs表面标志物的测定 取生长状态良好的第三代hBMSCs，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化收集细胞，调整细胞数为1×106/mL。PBS充分洗涤2次，弃上清，于待检测的样本中加入100 μL PBS，轻轻吹打制成细胞悬液，分装至4支流式试管，依次各加入10 μL荧光抗体Mouse IgG1-FITC、Mouse IgG2a-PE(同型对照)，CD44-FITC、CD34-PE，CD73-FITC、CD34-PE及CD45-FITC、CD34-PE，充分吹打混匀。常温下避光孵育30 min。测定前再加PBS至每管总体积500 μL，上流式细胞仪进行检测。

1.2.3 hBMSCs成骨诱导分化 第三代贴壁细胞达到100%融合后，用0.25%胰酶-EDTA消化，按每个孔1 000 cells/cm2接种于2个六孔板中，基础培养基(DMEM/F-12，10%FBS，1%双抗)进行培养。当细胞达到80%～90%融合后将细胞分为成骨诱导组和空白对照组。成骨诱导组用成骨细胞诱导分化培养基(0.1 μmol地塞米松、10 mmol β-甘油磷酸、60 μmol抗坏血酸、DMEM/F-12，10%FBS，1%双抗)在37 ℃、5% CO2的常氧条件下进行培养；空白对照组用基础培养基在与诱导组相同的条件下进行培养。每3 d换一次液，连续培养14 d后进行碱性磷酸酶细胞化学染色,21 d后行茜素红染色并镜下观察结果。

碱性磷酸酶染色：4%冷甲醛溶液固定细胞30 min后PBS缓冲液冲洗2遍，加入对甲苯胺兰盐(5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate)和四氮唑蓝染5 min，PBS洗涤2次,镜下观察诱导分化的细胞染色情况。

茜素红染色：4%冷甲醛溶液固定细胞30 min后PBS缓冲液冲洗2遍，再加入茜素红染液1 mL染色5 min，PBS洗涤2次，镜下观察茜素红钙化结节染色情况。

2 结 果

2.1 hBMSCs形态观察

细胞原代培养48 h后，倒置相差显微镜下可观察到有少量细胞贴壁生长，但细胞体积较小，无突起。96 h后贴壁细胞增多，呈长梭型、多角型(图1-A)；8 d后细胞分裂增殖加速，集落样增殖生长，呈漩涡状分布排列(图1-B)。14 d后细胞分布密集，铺满6孔板底部，呈鱼群样分布排列(图1-C)。

图1 不同培养时间hBMSCs形态观察(×200)

2.2 流式细胞仪检测hBMMSCs表面标志物

流式细胞仪检测第三代hBMSCs表面抗原CD44、CD73(hBMSCs相对特异性表面标志)均阳性，CD34(造血干细胞阳性)、CD45(白细胞阳性)阴性(图2)。

图2 流式细胞术检测hBMSCs表面抗原

2.3 成骨细胞的诱导分化

2.3.1 成骨细胞形态观察 hBMSCs向成骨细胞诱导培养1周后,细胞体积变大，由长梭形变为多角形，细胞内颗粒增多，细胞外基质分泌旺盛，培养液中可见颗粒状物质，并逐渐出现细胞交叉重叠，融合的细胞层面呈现“网格状”改变(图3-A)；培养2周后细胞轮廓模糊，聚集成团，可见颗粒状钙盐沉积(图3-B)。

图3 hBMSCs成骨细胞诱导形态(×200)

2.3.2 碱性磷酸酶染色 BMMSCs向成骨细胞诱导分化2周后，成骨诱导组进行碱性磷酸酶染色，细胞胞质中可见浅蓝色至棕黑色的细小颗粒；空白对照组细胞染色为阴性(图4)。

图4 hBMSCs成骨细胞诱导2周碱性磷酸酶染色(×200) 图5 hBMSCs成骨细胞诱导3周茜素红染色(×200)

2.3.3 茜素红染色 BMMSCs向成骨细胞诱导至3周后，细胞表面失去透光性，形成钙化结节。茜素红染色后，成骨诱导组细胞间出现多个致密红色小结，并可见到多个小结融合；空白对照组为阴性(图5)。

3 讨 论

目前用于hBMSCs分离的方法主要有5种：贴壁筛选法、密度梯度离心法、免疫磁珠法、特制培养板筛选法及流式细胞仪分离法[2-3]。本实验采用密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离纯化hBMSCs。首先利用密度为1.077 g·mL-1的人Percoll淋巴细胞分离液通过密度梯度离心的方法获得纯度相对较高的单个核细胞，人Percoll淋巴细胞分离液的密度介于单个核细胞及红细胞和多分叶核细胞之间，离心后单个核细胞位于Percoll的上方，而其余杂质细胞则沉于底部。然后利用hBMSCs易于贴壁生长的特性通过换液去除未贴壁细胞。本实验hBMSCs培养过程中，由于细胞生长状况和贴壁能力不同，48 h时如贴壁细胞较少而杂质细胞较多时可进行半量换液或补液，若贴壁细胞较多时可考虑全量换液。

hBMSCs的鉴定主要依靠以下几个条件：细胞贴壁性生长及形态特征，细胞表面标志的测定，多向分化能力(体外可分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞)等。首先，细胞原代培养48 h后，倒置相差显微镜下可观察到有少量细胞贴壁生长；96 h后贴壁细胞增多，呈长梭型、多角型；8 d后细胞分裂增殖加速，集落样增殖生长，呈漩涡状分布排列；14 d后细胞分布密集，铺满6孔板底部，呈鱼群样分布排列，所以本研究分离培养得到的细胞符合贴壁性及hBMSCs的形态特征。目前还没有发现特异性hBMSCs表面标志，一般认为表达CD13、CD29、CD44、CD73、CD166等，而不表达造血干细胞和内皮细胞的表面标志，如CD11、CD14、CD34和CD45等[4]。本研究利用流式细胞术对所培养细胞进行鉴定，结果显示hBMSCs特征性表面标志抗原CD44、CD73高表达，而造血干细胞标志性抗原CD34和CD45表达极低，提示密度梯度离心法结合贴壁筛选法培养获得的hBMSCs具有较高的纯度。

hBMSCs具有向成骨细胞分化的能力，但需要在一定诱导条件下才能分化为成骨细胞。研究表明，体外培养时在培养基中加入β-甘油磷酸、地塞米松和抗坏血酸后，hBMSCs即开始向成骨细胞分化，表现为碱性磷酸酶阳性，表达各种成骨细胞分泌的骨基质蛋白(I型胶原、骨韩素、骨桥素、骨涎蛋白等)[5]。地塞米松可以增强hBMSCs中碱性磷酸酶的活性，也能通过刺激骨祖细胞增殖分化提高靶细胞对其它激素、生长因子的敏感性，从而增强hBMSCs向成骨细胞分化的能力，地塞米松早期以促进基质合成为主，后期以促进钙化为主[6]。抗坏血酸可以促进体外培养细胞合成胶原，形成钙化，还可调节三磷酸腺苷及碱性磷酸酶活性，并影响其合成[7]。β-甘油磷酸作为碱性磷酸酶的底物，在培养液中迅速被有机磷酸酶水解，产生大量磷酸离子，磷离子是体外钙化所必需，因此β-甘油磷酸是hBMSCs发生矿化结节沉淀的必要条件[8]。本研究联合应用β-甘油磷酸、地塞米松、抗坏血酸诱导hBMSC向成骨细胞分化，表现出细胞形态改变，细胞体积增大，由长梭形变为多角形，胞浆内颗粒增多，细胞外基质分泌旺盛；碱性磷酸酶染色强阳性，茜素红染色可见大量橘红色沉淀，呈圆形或类圆型堆积成片状，这些均为典型成骨细胞特征表现。

本研究建立了hBMSCs体外分离培养、鉴定和成骨细胞诱导分化的技术平台，成功地获得了纯度较高的hBMSCs，并在体外定向诱导向成骨细胞分化，为临床应用干细胞移植治疗股骨头坏死、骨质疏松等疾病提供了实验基础参考。

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[责任编辑：李蓟龙 英文编辑：谢利峰]

Culture,Identification and Differentiation into Osteogenic Cells from Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Vitro

KANG Shao-ping1,LI Yong-sheng2,LIU Shu-yan1,et al

(1.Lab Medicine College,Hebei North University,Zhangjiakou 075000,Hebei China;2.Department of Orthopaedics,the Second Hospital of Zhangjiakou,Zhangjiakou 075000,Hebei China)

Objective To establish a set of methods of isolation,culture,identification and differentiation into osteogenic cells of human bone marrow mesenchymal stem cells (hBMSCs) in vitro.Methods Bone marrow specimen was obtained from the patient in hospital with femur neck fracture surgery,while hBMSCs were isolated by the methods of density gradient centrifugation and adherent screening.The cell morphology and phenotype were studied by inverted microscope and flow cytometry.Meanwhile,the cells in the third passage were cultured with osteogenic differentiation medium. Alkaline phosphatase and Alizarin red staining were used for identification.Results After 96 h with primary culture,adherent cells were observed and appeared long spindle and polygonal.The cells distributed in whirlpool after 8days. The flow cytometry showed cell surface markers CD44,CD73 were positive and CD34,CD45 were negative.For Alkaline phosphatase staining,light blue to dark brown particles could be seen in the cytoplasm of the 3rd passage cells after being cultured with osteogenic differentiation medium for 14 days.For Alizarin red staining,red calcium nodules appeared after osteogenic differentiation for 21 days.Conclusions The density gradient centrifugation and adherent screening could be an effective approach to obtain high purity of hBMSCs.In vitro,the cells could have potential to differentiate into osteogenic cells in certain induction medium and be the ideal donor cells of bone tissue engineering.

bone marrow mesenchymal stem cells;osteogenic cells;induction;differentiation

张家口市科学技术研究与发展计划项目(No.1321052D)

康少平(1980-)，女，河北张家人，医学硕士，讲师，主要研究方向：干细胞研究。

R 394.2

A

10.3969/j.issn.1673-1492.2015.05.013

来稿日期：2014-12-01