勾长龙，王雨琼，2，王 巍，赵晗旭，娄玉杰，2，高云航

(1.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春130118;2.吉林农业大学动物生产及产品质量安全教育部重点实验室，吉林长春130118)

纤维素类物质是自然界中最丰富的一类可再生资源［1］，由于其特殊的晶体结构，使其不能被充分利用，大部分被弃置［2］。纤维素酶是一种能够将纤维素分子降解为纤维二糖和葡萄糖等小分子物质的一组复合酶，现已被广泛应用于食品、医药、纺织、能源转化等领域［3］。但大部分酶的最适作用温度范围为45～65℃，需要长时间的加热和冷却的处理过程，而低温纤维素酶的最适作用温度范围为15～25℃［4］，较低的最适温度以及低温下的高效反应，不仅可以缩短处理时间、节省费用，同时只需温和的热处理即可使其丧失活力，降低了对酶理化性质的影响。因此低温纤维素酶已成为了酶学研究的热点之一，而产纤维素酶微生物的获得则是研究酶的首要前提［5］。目前研究者已从不同环境中分离获得多株低温产纤维素酶的菌株，曾胤新等［6］从北极楚科齐海分离到一株产低温纤维素酶的交替假单胞菌Pseudoalteromonas sp.BSW20308，5℃时仍可保持50%的纤维素酶活力;Fu xiaoyu等［7］从海洋中分离获得一株芽孢杆菌Bacillus.sp BME－14，在5℃时纤维素酶活为最大酶活的65%。本研究从长白山土壤和牛粪中筛选出两株低温下具有较高纤维素酶活的真菌菌株，对两株菌的形态特征、生长性质、及产酶性质进行了研究，以期为低温纤维素酶规模化生产和应用奠定研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试材料 ①牛粪，采样时间:2012年1月，采样地点:吉林农业大学牛场，用铁锹除去粪堆表层冻结的粪便和杂物，取粪堆中层处于结冻临界点的粪样置于自封袋中 (无菌操作)，带回实验室后置于4℃冰箱保存;②长白山土壤，采样时间:2012年2月采样地点:长白山南坡山麓下(E127°23＇，N41°32＇)，采样深度 5 ～ 20 cm，无菌采集后置于装有冰袋的保温箱中带回实验室置于4℃冰箱保存。

1.1.2 培养基 ① 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基):马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水1000 mL，pH自然，高压灭菌30 min。② 羧甲基纤维素钠培养基［8］:羧甲基纤维素钠20 g，酵母膏0.5 g，Na2HPO42.5 g，KH2PO41.5 g，蛋白胨2.5 g，琼脂15 g，蒸馏水定容至1000 mL，pH:7.0～7.2，高压灭菌30 min。③ 产酶发酵培养基:羧甲基纤维素钠5 g，牛肉膏5 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，蒸馏水 1000 mL，调pH7.0，高压灭菌30 min。

1.2 耐低温纤维素酶高产真菌菌株的初筛

称取10 g样品转移至盛有90 mL无菌水的锥形瓶中，摇床振荡2 h后静置1 h。取上清液稀释为10－1～10－7七个稀释度，分别涂布于PDA培养基上，15℃培养3～7 d。根据菌落形态特征挑取单个菌落点种于羧甲基纤维素钠培养基上培养5 d，加入刚果红染色15 min，然后用1 mol/L NaCl浸洗15 min［9］，挑选出水解圈直径 (D)与菌落直径(d)比值较大的菌株进行保存。

1.3 耐低温纤维素酶高产真菌菌株的复筛

将初筛菌株接种到装有50 mL产酶发酵培养基的250 mL三角瓶中，15℃、160 r/min条件下培养3 d，4000 r/min离心10 min得到粗酶液。

用3，5－二硝基水杨酸法 (DNS)测定菌株的纤维素酶活力即滤纸酶活力 (Filter paper enzyme activity简称为 FPA)。酶活单位 (U/mL)定义:每mL粗酶液每min水解滤纸产生1 μg葡萄糖所需要的酶量定义为1个酶活力单位［10］。

1.4 耐低温纤维素酶高产真菌的形态学鉴定

参照《微生物分类学》［11］和《真菌鉴定手册》进行菌落形态和培养特征观察［12］，利用插片法培养真菌，15℃培养3 d，取出已经被菌丝体覆盖的盖玻片，置于载玻片上，通过光学显微镜观察孢子和菌丝的形态。

1.5 耐低温纤维素酶高产真菌的分子生物学鉴定

真菌DNA提取按参考文献［13］进行。以提取两菌株的基因组为模板，利用真菌核糖体rDNA内转录间隔区ITS通用引物 (ITS1:5’－TCCGTAGGTGAACCTGCGG－3’;ITS4:5’－TCCTCCGCT-TATTGATATGC－3’)进行 PCR扩增，PCR回收产物与载体pMD－18T连接后转化Escherichia coli DH5a感受态细胞，筛选阳性克隆，经菌落PCR鉴定后送生工基因公司进行测序。所得序列与Gene-Bank数据库中序列进行 Blast分析比对，利用MEGA6.0构建系统进化树，根据菌株间的亲缘关系确定菌株的种属。

1.6 耐低温纤维素酶高产真菌菌株的产酶条件优化

1.6.1 孢子悬浮液的制备 刮取F－3I和FF2－2的斜面菌种接种到马铃薯葡萄糖液体培养基中，置于振荡培养箱中15℃、160 r/min振荡培养3 d，制成孢子悬浮液备用。

1.6.2 碳源对酶活的影响 改变产酶发酵培养基中的碳源，备选碳源分别为羧甲基纤维素钠、葡萄糖、蔗糖、淀粉、秸秆、麸皮。将孢子悬浮液以2%的接种量接入培养基中，15℃，160 r/min振荡培养3 d，测定滤纸酶活力 (FPA)，试验重复3次，结果取平均值。

1.6.3 氮源对酶活的影响 确定最佳碳源后，采用不同的氮源取代发酵培养基的氮源，备选氮源分别为:牛肉膏、酵母粉、蛋白胨、硫酸铵、牛肉膏和蛋白胨混合物、硫酸铵和酵母粉混合物。研究不同氮源对菌株酶活力的影响。以2%的接种量将孢子悬浮液接种到发酵培养基中，15℃、160 r/min振荡培养3 d，测定滤纸酶活力 (FPA)，试验重复3次，结果取平均值。

1.6.4 pH值对酶活的影响 确定最佳碳源、氮源后，将发酵培养基的初始 pH值分别调为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，以2%的接种量将孢子悬浮液接种到发酵培养基中，15℃，160 r/min振荡培养3 d，测定滤纸酶活力 (FPA)，试验重复3次，结果取平均值。

1.6.5 发酵温度对酶活的影响 确定了最佳碳氮源和pH后，设置菌株发酵温度分别为4、10、15、23、30和37℃，按2%接种量接种到发酵培养基中，160 r/min振荡培养3 d，测定滤纸酶活力(FPA)，试验重复3次，结果取平均值。

1.6.6 发酵时间对酶活的影响 在确定上述条件的基础上，将孢子悬浮液以2%的接种量接种到发酵培养基中，23℃、160 r/min振荡培养 (分别培养1～6 d)，测定滤纸酶活力 (FPA)，试验重复3次，结果取平均值。

1.7 数据处理

试验数据采用Microsoft Excel和SPSS软件进行整理和统计，用SPSS统计软件进行单因素方差分析，用邓肯氏新复极差测验法DMRT(Duncan's Multiple Range Test，DMRT法)进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 耐低温纤维素酶高产真菌菌株的筛选

利用刚果红染色法重复筛选后，从牛粪中分离出10株，从长白山土壤中分离出12株能够产生清晰水解圈的真菌菌株，挑出其中6株水解圈较大的菌株 (见图1)进行摇瓶发酵复筛，复筛结果如表1所示。

表1 菌株滤纸酶活测定结果1)Table 1 FPA activity results of strains

从表1可见，菌株FF2－2(分离自牛粪)和F－3I(分离自长白山土壤)具有较高的产纤维素酶活性。

图1 刚果红染色后的水解圈Fig.1 The hydrolytic zone on the screening plateA:FF2－2;B:F－3

2.2 耐低温纤维素酶高产真菌菌株的形态学鉴定

菌株FF2－2菌落丝绒状 (图2A)，前期白色，后期为黄绿色。显微镜下观察分支稀少，分生孢子串生，基内菌丝发达，气生菌丝不发达，分生孢子梗无横隔，菌丝末端膨胀成半圆形顶囊，顶囊上覆盖着辐射状小梗，小梗上产生分子孢子链，分生孢子椭圆形或者球形直径为3.75～5.15 μm(图2 C)，初步鉴定菌株为短梗霉属 Aureobasidiu.sp［10－11］。

菌株F－3I的菌落初期圆形致密生长 (图2 B)，菌丝绒状，后期产生白色分生孢子。显微镜下观察气生菌丝顶端不膨大，菌丝和分生孢子梗都有横隔，菌丝膨大的顶端形同扫帚状，分生孢子呈圆形或者椭圆形，直径为2.5～3 μm(图2 D)，菌株 F－3I初步鉴定为曲霉属 Aspergillus sp［10－11］。

图2 二株真菌的菌落形态和显微形态特征Fig.2 The micromorphology and Colony morphology of strainsA:FF2－2的菌落形态;B:F－3I的菌落形态;C:FF2－2的显微形态特征;D:F－3I的显微形态特征

2.3 菌株的分子生物学鉴定

2.3.1 菌株的ITS rRNA序列鉴定 采用CTAB法提取两菌株的总DNA，获得核苷酸片段大小约为22000 bp(图3左)，以两菌株基因组DNA为模板，利用一对真菌 ITS通用引物进行PCR，取3 μLPCR产物进行w=1%琼脂糖凝胶电泳，分别得到了542、528 bp的核苷酸片段，其大小与预期结果相符 (图3右)。

图3 两株真菌总基因组提取结果 (A)PCR产物电泳结果 (B)Fig.3 The electrophoresis analysis of two fungi total DNA(A)and PCR product(B)A:M1为DNA相对分子质量标准 (λHindIII);L1、L2分别为FF2－2、F－3I基因组DNA;B:M2为DNA相对分子质量标准 (DL2000 Marker);L1、L2分别为FF2－2、F－3I ITSPCR产物

2.3.2 序列比对及基因系统进化树的构建 两株真菌ITS rRNA序列扩增产物经胶回收纯化后，与克隆入pMD18－T载体连接转化后，送至上海生工生物公司测序，菌株FF2－2、F－3I的核苷酸片段大小分别是542、528 bp。根据BLAST和DNAMAN软件对测得的核苷酸序列进行比较分析，并利用MegAlign软件构建基因系统进化树，如图4A和图4B所示。

图4 基于ITS rRNA序列同源性菌株FF2－2(A)和F－3I(B)的系统发育树Fig.4 The phylogenetic trees of stain FF2－2(A)and F－3I(B)based on ITS rRNA sequence

由图4可知，菌株 FF2－2与Aureobasidium pullulans strain CID 114的亲缘关系最近，同源性为100%;菌株 F－3I与 Aspergillus versicolor strain NHRC－EC043的亲缘关系最近，同源性为100%。结合形态学特征，最终确定菌株FF2－2为短梗霉属的出芽短梗霉Aureobasidium pullulans，菌株F－3I为曲霉属的花斑曲霉Aspergillus versicolor。

2.4 菌株的产酶条件优化

2.4.1 碳源对酶活力的影响 由图5可知，在不同碳源下，菌株F－3I的酶活力差异显著，以淀粉为唯一碳源时，酶活力最高 (11.42±0.66)U/mL，麸皮次之 (8.32±0.20)U/mL;菌株FF2－2在以葡萄糖、淀粉、秸秆为碳源时，酶活力差异不显著，而以麸皮为碳源时，酶活力与以其它碳源时的酶活力差异极显著，最高酶活力达到 (15.32±1.09)U/mL，由于麸皮属于天然可再生资源，价格较为廉价，且在实际应用中可行性更高，因此两株菌均采用麸皮为最佳碳源进行深入性研究。

图5 不同碳源对菌株FF2－2和F－3I酶活力的影响Fig.5 Effects of different carbon sources on the enzyme activity of strain FF2－2 and strain F－3I

2.4.2 氮源对酶活力的影响 由图6可知，在不同氮源下菌株F－3I的各酶活力差异显著，以牛肉膏为氮源时，酶活力最高;菌株FF2－2在以牛肉膏和蛋白胨为氮源时酶活力无显著差异，酶活力显著高于其它氮源时的酶活力，两菌株在以硫酸铵为氮源时酶活力均为最低。

图6 不同氮源对菌株FF2－2和F－3I酶活力的影响Fig.6 Effects of different nitrogen sources on the enzyme activity of strain FF2－2 and strain F－3I

2.4.3 初始pH对酶活力的影响 在pH为6和7时，菌株F－3I的产酶活力无显著差异，与其它pH条件下的酶活力差异显著;菌株FF2－2在PH为7时产酶活力与其它PH时酶活力差异极显著，酶活力高达 (25.77±0.79)U/mL，说明2株菌在中性环境下均能较好的生长和产酶。如图7所示。

图7 不同初始pH对菌株FF2－2和F－3I酶活力的影响Fig.7 Effects of different initial pH on the enzyme activity of strain FF2－2 and strain F－3Ion enzyme activity

2.4.4 温度对酶活力的影响 由图8可知，温度在4～23℃之间时，两株菌的酶活随温度的升高逐渐升高，4个温度下两株菌的酶活力均差异显著;当温度为23℃时，菌株F－3I的酶活达到最高，为 (22.33±1.26)U/mL，而菌株FF2－2在23℃和30℃时的酶活力差异不显著，此时酶活力最高。当培养温度高于23℃时，随着温度的升高，酶活力呈下降趋势。

2.4.5 时间对酶活力的影响 由图9可知，菌株F－3I在发酵前2 d酶活力差异不显著，随着时间的增长，在第5天时酶活力达到最高值;而菌株FF2－2在培养第3天时，产酶活力最高。

图8 不同温度对菌株FF2－2和F－3I酶活力的影响Fig.8 Effects of different temperature on the enzyme activity of strain FF2－2 and strain F－3IF－3I的显著性用大写字母表示，FF－2的显著性用小写字母表示，不同字母表示差异性显著 (P＜0.05)

图9 不同时间对菌株FF2－2和F－3I酶活力的影响Fig.9 Effects of different time on the enzyme activity of strain FF2－2 and strain F－3IF－3I的显著性用大写字母表示，FF－2的显著性用小写字母表示，不同字母表示差异性显著 (P＜0.05)

3 讨论与结论

目前低温微生物的获得主要来源于极端环境，张淑红等［14］从青藏高原冰山雪样中分离出假单胞菌属的低温纤维素降解菌LHG－C－9，其生长范围在－5～30℃，最适产酶温度为30℃;吕明生等［15］从连云港海域的海水和海泥中分离得到低温产纤维素酶菌株Z6，其生长温度范围在4～35℃，最适产酶温度为25℃。极端环境中微生物的数量和种类固然繁多，但这些环境超低温、强辐射、冻融的寡营养状态增加了微生物培养的难度［16］，同时样品的获得也十分艰难，因此不能被广泛的深入研究。本试验从长白山地区的土壤和牛粪中通过温度诱导分离出两株高效的纤维素降解菌，生长温度和产酶温度与张淑红、吕明生的研究结果相符合。这充分说明普通环境中同样能够获得具有高催化特性的低温微生物，同时样品采集便利，节省资金，而且实际应用中适应性更强。

近年来研究比较多的低温菌主要有交替假单胞菌Pseudoalteromonas、芽孢杆菌Paenibacillus、木霉Trichodermal、青霉Penicillium、以及根霉 Rhizopus ehrenberg［5］。本文获得的两株低温纤维素分解菌FF2－2和F－3I，经形态学和ITS rRNA分子生物学鉴定FF2－2为短梗霉属的出芽短梗霉Aureobasidium pullulans，菌株F－3I为曲霉属的花斑曲霉Aspergillus versicolor;目前A.pullulans的研究主要在生物防治领域以及产普鲁兰多糖方面，Zhang Dianpeng等［17］研究A.pullulans对桃子采后病害的防治效果;高璇璇等［18］通过紫外诱变出芽短梗霉来提高普鲁兰多糖的产量。而对A.versicolor的研究主要集中于菌丝体中化学成和次级代谢产物方面，Krupiński M 等［19］从 A.versicolor IM 2161 提取化学成分来消除壬基酚的毒性作用;张连庆等［20］提取A.versicolor ZLQ－43的次级代谢产物抑制肿瘤细胞;目前尚未发现出芽短梗霉 A.pullulans和花斑曲霉A.versicolor产低温纤维素酶的报道，因此这两株菌具有很大的开发潜力。

本试验同时测定了5种因素对两菌株产酶活力的影响。在碳源方面，发现在以麸皮为唯一碳源时菌株FF2－2的酶活力远远高于其它物质作为碳源时的酶活力，而菌株F－3I在以麸皮为唯一碳源时，同样具有较高的酶活力。在实际生产过程中麸皮作为农业废弃物，不仅较容易获得，同时价格低廉，具有很强的生产应用价值。在温度方面，目前已报道的中高温纤维素分解菌，酶活性受温度影响较大，一般在45～65℃范围内获得最大酶活力，而低于45℃时，随着温度下降酶活性逐渐减弱或者丧失［4］。而本试验筛选出的两株纤维素分解菌均能在23℃时获得最大酶活力，随着温度升高，酶活力反而下降，这说明该酶对热较敏感。同时最适产酶温度也符合Margensin等［21］提出的最适反应温度在30℃左右的酶属适冷酶范畴。

本试验通过反复筛选分别从牛粪和长白上土壤中成功筛选出菌株FF2－2、F－3I，经形态学、分子生物学鉴定菌株FF2－2为短梗霉属的出芽短梗霉，F－3I为曲霉属的花斑曲霉。经产酶条件优化后菌株FF2－2和F－3I产酶的最适碳源分别是w=0.5%的麸皮、w=0.5%的淀粉;最适氮源分别为w=1%牛肉膏和硫酸铵混合物、w=1%牛肉膏;最适初始pH分别为7.0、6.0;最适发酵温度均是23℃;最适发酵时间分别是3 d和5 d。优化后菌株FF2－2的FPA酶活力提高了2.6倍，菌株F－3I FPA酶活力提高了5.5倍。

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