张鹤千，杨子拓，李桂峰，肖诗斌，孙际佳，杨慧荣，赵会宏，谢堂晖，韩兴鹏，刘 丽

(1.华南农业大学动物科学学院，广东广州510642;2.中山大学生命科学大学院，广东广州510275;3.华南农业大学动物科学学院//广东省农业动物基因组学与分子育种重点实验室，广东广州510642)

黄颡鱼Pelteobagrus fulvidraco在分类学上属于硬骨鱼纲、鲇形目Silurforwes、鲿科Siluridae、黄颡鱼属Pelteobagrus，俗名叫黄刺公、黄腊丁、黄刺骨等［1］。黄颡鱼在静水或缓流的浅滩生活，昼伏夜出，主食底栖脊椎动物，多为小鱼、水生昆虫等小型生物。黄颡鱼是中国重要的小型经济鱼类，广泛分布于长江、黄河、珠江、沅江及黑龙江等水域［2－3］。黄颡鱼属在我国主要有4种，分别为黄颡鱼Pelteobagrus fulvidraco、瓦氏黄颡鱼Pelteobagrus vachelli、光泽黄颡鱼Pelteobagrus nitidus、岔尾黄颡鱼Pelteobagrus eupogon，其中黄颡鱼是我国水产养殖品种中主要的增养殖对象，其次是瓦氏黄颡鱼。珠江流域是由西江、北江、东江及珠江三角洲诸河等四个水系所组成的复合流域［4］。随着经济社会的发展，环境污染不断地加剧，滥捕滥捞现象也日趋严重，致使野生黄颡鱼的生活环境受到了严重破坏，野生种质资源数量呈现锐减趋势。为了合理有效地保护野生黄颡鱼群体以促进淡水渔业的长久发展，对珠江流域黄颡鱼野生群体的种质资源进行研究已日显重要。

线粒体DNA(Mitochondrial DNA，mtDNA)基因组内不同的区域进化速度存在差异，适合不同水平的进化研究［5］。近年来，随着分子生物学技术向经典分类学领域的渗透以及鱼类线粒体DNA研究技术的不断发展成熟，使得mtDNA成为鱼类学相关研究的理想的分子标记，并在鱼类进化遗传学、种群遗传结构、分子生态学和保护生物学等方面的研究中取得了很多有意义的成果，解决了众多疑难问题。细胞色素b(Cyt b)基因进化速度适中，适合于种间到种内水平上的系统发生研究，在鱼类群体遗传结构与系统发育关系中有着广泛的应用［6］。目前，Cyt b基因是研究分子进化和系统发育最有用的基因之一，已广泛应用于各种生物的系统发育研究中［7－9］，而且还被用于探讨分歧时间较长的高级分类单元之间的系统发育关系［10］。

本文通过测定与分析珠江流域桂林江段、都匀江段、右江江段、左江江段、东江江段这5个江段的190尾野生黄颡鱼个体的线粒体细胞色素b基因序列，探讨珠江流域野生黄颡鱼的种群遗传多样性和进化关系，在维护不同水系间遗传多样性和原有的生态平衡上具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 实验用鱼 本实验所用野生黄颡鱼样本于2012年6月至8月，采集于珠江流域各江段，分别为桂林江段 (GL)、都匀江段 (GZ)、右江江段(YJ)、左江江段 (ZJ)、东江江段 (DJ)，共计190尾，每个群体采集样本数目见表1。野外现场取背部肌肉于无水乙醇中固定并带回实验室，超低温保存。

1.1.2 主要仪器 PCR反应所用DNA扩增仪为南京贝登机电设备有限公司制造V123530型扩增仪，离心机为德国Eppendorf公司制造5810R型，凝胶成像系统为美国BIORAD公司制造的Bio-Rad Gel-Doc XR system PC型等。

表1 黄颡鱼群体采样信息Table 1 Pelteobagrus fulvidraco groups sampling information

1.2 试验方法

黄颡鱼的基因组DNA的抽提实验采用天根生物海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒 (TIANamp Marine Animals DNA Kit)，并根据本实验室的实际情况对操作流程进行了部分更改。Cyt b基因扩增和测序的引物为通用引物序列［11］如下:

H15915:5'－CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC－3'，

L14724:5'－GACTTGAAAAACCACCGTTG－3'，引物由华大基因科技服务有限公司合成。

PCR反应总体积为50 μL体系，其中模板DNA2 μL，上游引物P1和下游引物P2(10 μmol/L)各 2 μL，2 ×PCR Reaction Mix25 μL，Taq DNA聚合酶 (2.5 U/μL)1 μL，无离子超纯水为18 μL。扩增条件为:94℃预变性2 min后94℃变性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸90 s，共进行35个循环，最后72℃延伸7 min，16℃保存。扩增之后用w=1%的琼脂糖凝胶电泳，BIORAD凝胶成像系统照胶并保存图片。

1.3 测序与数据分析

PCR扩增产物直接送华大基因科技服务有限公司利用正反引物进行双向测序获得黄颡鱼的Cyt b基因序列列，经过DNASTAR Inc软件拼接后进行人工校对。用软件Clustal-X对所获得拼接序列进行对比分析［12］;用软件DNASP5.0计算单倍型多样性 (haplotype diversity，Hd)、核苷酸多样性(nucleotide diversity，Pi)和平均核苷酸差异数 (K±SD)3项群体遗传多样性指标，群体间的分化指数(F-statistics，Fst)以及群体遗传变异的分子变异等级分析(analysis of molecular variance'AMOVA);通过公式Nm= ［(1－Fst)－1］/2计算得到群体间的基因流;MEGA5.0软件统计DNA序列的剪辑组成、转换、颠换和平均转换率/颠换率、单突变位点、简约信息位点、插入/缺失位点数;个体间、群体间和群体内的遗传变异率由Kimura双系数模型(Kimura2-parameter)计算所得;利用MEGA5.0软件，最大似然法 (maximum-like-lihood，ML)构建聚类关系树。

2 结果与分析

2.1 Cyt b基因序列特征

5个江段的野生黄颡鱼mtDNA Cyt b的扩增产物利用Clustal-X 1.81和MEGA 5.0软件进行人工比对序列，并对数据进行适当的剪切处理，确定黄颡鱼Cyt b基因片段全长为1109 bp。由MEGA5.0软件对1109 bp的序列进行分析可得，5个江段的190尾样本基因片段中，T、C、A和G碱基平均含量分别为27.4%、31.0%、27.7%、13.8%，可见C碱基含量相对较高，G碱基含量相对较低，其中A+T的含量 (55.1%)显著高于G+C含量(44.8%)，具体可见表2。总共检测到43种单倍型，序列中东江 (DJ)、左江 (ZJ)和右江 (YJ)的样品的变异位点数目均大于100个，分别为230(约占20.7%)、193(约占17.4%)、352(约占31.7%)个，都匀 (GZ)与桂林 (GL)江段的样品的变异位点个数分别为8个和14个;5个江段的样品检测到的简约信息位点分别是东江为192个、左江142个，右江307个，都匀4个，桂林5个 (表3)。经检测群体内的转换/颠换 (Ts/Tv)之比分别为:DJ为4.07，ZJ为3.91，YJ为2.44，GZ为8.25，GL为5.51。由转换、颠换对遗传距离图 (图1)可知:转换和颠换数没有达到平台效应，即没有达到饱和状态，说明供统计分析的数据准确可靠。此外，都匀和桂林群体转换位点均为1个，没有颠换位点，转换远高于颠换，表明此片段没有饱和，适合进行遗传变异分析。

图1 Cyt b基因转换、颠换与遗传距离之间关系的散点图Fig.1 Transition and transversion substitutions vs.genetic distance of mitochondrial Cyt b gene

表2 黄颡鱼线粒体Cyt b基因碱基组成Table 2 Base composition of mitochondrial Cyt b gene of Pelteobagrus fulvidraco %

表3 黄颡鱼Cyt b基因序列保守位点、变异位点、简约信息位点Table 3 The conserved sites、variable sites、parsimony-informative sites of mitochondrial Cyt b gene of Pelteobagrus fulvidraco 个

2.2 群体变异和遗传结构

利用MEGA5.0软件分析测序获得的190尾样品的mtDNA Cyt b基因序列，得到5个江段群体间的遗传距离 (表4)。从种间遗传距离来看，东江采样的黄颡鱼群体和右江采样的黄颡鱼群体的种群间的遗传距离最远为0.084，遗传距离最近的为都匀和桂林群体 (0.001)。经比较分析，种群内部遗传距离从大到小依次为:YJ(0.095)＞ZJ(0.068)＞DJ(0.053)＞GZ(0.001)=GL(0.001)。

从各个地理群体的核苷酸多样性 (Pi)来看，核苷酸多样性均在0.00072～0.08445之间，因此可以得出，黄颡鱼各群体的线粒体Cyt b基因的核苷酸变异均处于较低水平，而从平均核苷酸差异数比较中，右江群体 (YJ)最高，其次依次为左江群体 (ZJ)、东江群体 (DJ)和桂林群体 (GL)，而都匀群体 (GZ)最低。

本实验结果显示，5个群体间的Fst及Nm值见表5，所示结果左江 (ZJ)与右江 (YJ)群体间的Fst值为0.02604，数值在0～0.05之间，表明2个黄颡鱼群体间存在中等偏低的遗传分化，不存在显著的系统地理格局。本研究中群体间的遗传分化系数在0.02604～0.41430之间，都匀 (GZ)跟广西崇左 (ZJ)的遗传分化程度最大，右江和左江的遗传分化程度最小。在本实验中，5个群体间的基因流系数Nm在范围0.35342～9.35061之内，其中，GZ和ZJ的Nm值最小 (0.35342)，而ZJ和YJ的Nm值最大 (9.35061)。

分别将东江、桂林、都匀、左江和右江5个江段群体，左右江流域与东江流域二群体，左右江流域两群体作为一个组，运用Arlequin软件进行群体间的分子变异等级分析 (AMOVA)(表6)，结果表明:5个群体总的遗传分化系数Fst=0.24774(P=0.00±0.000＊＊＜0.05)，差异极显著。

表4 黄颡鱼的Cyt b基因序列群体间遗传距离Table 4 The interpopulation genetic distances of mitochondrial Cyt b gene of Pelteobagrus fulvidraco

表5 黄颡鱼群体间的Fst(对角线下方)和Nm(对角线上方)Table 5 The interpopulation Fst(on triangle)and Nm(lower triangle)of Pelteobagrus fulvidraco

2.3 聚类分析

利用MEGA5.0软件分析5个江段的黄颡鱼个体的 mtDNA Cyt b基因序列，并用最大似然法(Maximum Likelihood)进行聚类分析，得到分子系统发生树 (图2)。图中各枝上数字为1000次Bootstra P自展法检验统计分析后对该枝的支持率，数值越大，支持率越高，则表明该树的可信度越高。一般认为，数值＞70%，即表明该枝的可靠性比较大。5个黄颡鱼采样江段中左江和右江群体先聚为一支，桂林和都匀聚为一支，采自于东江的3号个体单独聚为一支。

表6 黄颡鱼5个群体间遗传变异的分子变异等级分析 (AMOVA)1)Table 6 Analysis of molecular variance(AMOVA)of five populations of Pelteobagrus fulvidraco

图2 珠江水系野生黄颡鱼Cyt b基因序列的ML分子系统树Fig.2 The molecular phylogenetic tree of wild Pelteobagrus fulvidraco from the Pearl River by ML method based on Cyt b

2.4 中性检测结果

通过应用DNASP5.0软件分别对5个江段的野生黄颡鱼Cyt b基因序列进行中性检测，得到Fu's Fs值和Tajima's D值 (结果见表7)，从而揭示黄颡鱼是否经历过种群扩张。结果表明，桂林和都匀2个群体的 Fu's Fs值是小于0且 P值不显著，Tajima's D检验D值小于0且P值不显著，左江和右江群体Fu's Fs值是大于0且Tajima's D检验D值大于0，东江群体Fu's Fs值是大于0，Tajima's D检验D值小于0但P值不显著。

表7 黄颡鱼Cyt b基因Fu'S Fs和Tajima's D检验1)Table 7 The Test of Fu'S Fs and Tajima's D of mitochondrial Cyt b gene of Pelteobagrus fulvidraco

3 讨论

遗传多样性 (Genetic diversity)是生物多样性的核心，是生物种内和种间遗传变异的总和，是生物进化和物种分化的基础［13］。

3.1 黄颡鱼的遗传多样性分析

本研究中5个江段群体的野生黄颡鱼Cyt b基因序列的碱基组成分别为 A(27.7%)、T(27.4%)、C(31.0%)、G(13.8%)，其中G的含量显著低于其他碱基的含量，表现出明显的反G偏倚，显示出细胞色素b基因的共同特征［14］，这也是线粒体DNA的一个特点［15］。与多数硬骨鱼类相似［5］，碱基组成差异不大，分布比较平均。

右江 (YJ)群体的遗传多样性最高 (Hd=0.92038)，属于高单倍型。将珠江水系的野生黄颡鱼5个江段的群体作为一个整体，其Hd和Pi值分别为0.84857和0.04817，呈高单倍型、低核苷酸多样性的分布模式，表明其遗传多样性相对中等。与钟立强等［16］在研究长江中下游5个湖泊黄颡鱼种群线粒体细胞色素b基因的遗传变异分析中所得结果所示基本一致，黄颡鱼的平均单倍型多样性为0.945，核苷酸多样性为0.00419，其结果均呈现黄颡鱼的遗传多样性表现为中等水平。物种的遗传多样性的高低与其适应能力、生存能力和进化潜力密切相关，遗传变异是有机体适应环境变化的必要条件［17－18］。因此，加强对现有资源科学管理和保护、恢复有效种群大小、丰富遗传多样性是保护野生自然资源的基础［19］。

3.2 黄颡鱼的遗传变异分析

遗传多样性是指生物种内和种间的遗传变异度，是生物适应环境与进化的基础［20］。物种对生存环境的适应能力以及其进化的潜力依靠种群内遗传变异的大小，也依赖于遗传变异的种群结构［21］。单倍型之间的遗传距离是衡量一个物种或群体的mtDNA变异程度的重要指标［22］。研究表明，遗传距离是衡量群体间遗传变异程度的可靠参数，遗传距离越大表明群体间亲缘关系越远。利用软件MEGA5.0计算5个江段的野生黄颡鱼各群体间和群体内的遗传距离，其结果均在0.001～0.08之间，遗传距离较小，则均显示地理群体间有较近的亲缘关系。

群体遗传学认为，Fst值可以表示群体间的分化程度。根据Wright［23］提出的标准，一般指当0＜Fst＜0.05时表示分化较弱或者表示群体间无分化，当0.05＜Fst＜0.15时表示遗传分化中等，如0.15＜Fst＜0.25时，则表示遗传分化较大，而超过0.25表示遗传分化极大或表明群体呈高度分化。本研究中，5个野生黄颡鱼地理群体间的遗传分化系数在0.02604～0.41430之间，都匀跟左江江段群体的遗传分化程度最大，左江和右江江段群体的遗传分化程度最小。左江和右江群体间的Fst值为0.02604，数值在0～0.05之间，表明2个江段野生黄颡鱼种群间存在中等偏低的遗传分化，不存在显著的地理隔离现象。而都匀与左江的地理位置相对较近，遗传分化程度却最大，原因可能是由于都匀和左江流域之间有红水河流域隔开，加之左江水电站的建立更加大了2个江段群体间野生黄颡鱼的遗传分化的原因。

基因流Nm通常被用来评价不同地理群体间基因交流的程度。Nm值的大小与2个群体间基因交流的程度呈正相关，即当Nm的值越大，表示2个群体间的基因交流频繁，反之亦然。Wright认为:当Nm远远小于1，种群会被强烈的分化，表明2个群体间的基因交流有限，存在一定的地理隔离;当种群基因流系数Nm＞1时，种群间存在一定的基因流动，有较高的基因交流水平;如果Nm＞4，表明是2个群体是随机交配，基因交流频繁［24］。本实验中，5个江段间黄颡鱼的基因流系数Nm在范围0.35342～9.35061之内，其中，都匀和左江江段群体间的Nm值最小，说明存在一定地理隔离，基因交流有限，而左江和右江群体间的Nm值最大，远大于4，说明2个群体间基因交流频繁，而且左右江的距离也是相对来说最近的，也验证了地理位置是原因之一。黄颡鱼是一种生态适应性很强的鱼类，不同水系的居群借助于水系的连通而发生基因交流的可能性很大，5个江段的黄颡鱼生境差异不明显，在一定程度上为群体间的基因交流提供了有利条件，这可能是造成不同江段珠江流域间野生黄颡鱼群体没有明显遗传分化的原因之一。

3.3 黄颡鱼的种群动态分析

本研究应用中性检测来判断种群是否经历过扩张。应用Tajima's D与Fu's Fs值中性检验推测种群历史时，如果Tajima's D与Fu's Fs值呈负值，且在统计学上达到显著标准，则说明序列中含有比中性进化模型更多的核苷酸位点变化，可能预示着被研究种群曾经经历过一个扩张的历史［25］。

通过应用DNASP软件分别对5个江段的野生黄颡鱼Cyt b基因序列进行中性检测，得到Fu's Fs值和Tajima's D值，结果表明，桂林和都匀2个江段的黄颡鱼群体的Fu's Fs值是小于0且P值不显著，Tajima's D检验D值小于0且P值不显著，左江、右江群体Fu's Fs值是大于0且Tajima's D检验D值大于0，东江群体Fu's Fs值是大于0，Tajima's D检验D值小于0但P值不显著，均表明群体没有发生过种群扩张，种群数量相对稳定。

物种的遗传多样性反映了一个物种对环境的适应能力、生存能力和进化潜力，其遗传多样性越丰富，对环境的适应能力就越大，生存和进化的能力也越强。保护珠江及其流域内各支流和湖泊中鱼类的遗传多样性是我国重要的渔业管理政策。根据本实验结果显示，珠江流域野生黄颡鱼的遗传多样性处于相对较低的水平，已经达到亟需保护的状态。所以，有必要提前采取适当的管理策略以维持其野生资源的可持续性开发以及维护不同水系间遗传多样性和原有的生态平衡。

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