刘兴艳,潘 军,顾一洪,雷 智,兰 昊,敖晓琳,罗 超

(四川农业大学食品学院,四川雅安 625014)

四株野生酵母菌株耐受性的研究

刘兴艳,潘 军,顾一洪,雷 智,兰 昊,敖晓琳,罗 超

(四川农业大学食品学院,四川雅安 625014)

酿酒酵母对于葡萄酒风味形成起着重要的作用,使用产区酵母酿造葡萄酒可以突出产区的典型特色,从而避免我国葡萄酒在品种和风格上的单一。本实验利用WL培养基从采自攀枝花的葡萄自然发酵液中分离了酿酒酵母,结合显微镜下的细胞形态,及26S rDNA D1/D2区的序列分析和比对,成功分离得到四株酿酒酵母。进一步对这四株菌株的耐受性(高渗透压、高温、营养饥饿、高糖浓度、高浓度酒精、低pH)进行了研究,结果发现四株菌在上述耐受性方面有一定差异,以菌株C1和M1相对较佳。

葡萄酒,酿酒酵母,分离,鉴定,耐受性

葡萄酒的酿造是酵母菌利用葡萄中的糖分生成酒精,同时形成一系列风味物质的过程,葡萄酒的风味主要来源于葡萄酒的本身品质和酵母发酵代谢产物的特性,其中酵母对于葡萄酒风味物质的形成起着重要的作用[1]。葡萄酒酿造中有多种微生物参与,但以酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)最为重要[2]。原始的葡萄酒发酵直接利用了附着在葡萄果实上的酵母进行自然发酵,在此过程中该地区特有的生物群也参与了发酵,赋予了葡萄酒特有的风味[3]。但自然发酵法得到的葡萄酒品质不稳定,各年份各批次之间差异较大[4]。因此,为了获得迅速可靠的发酵,通常采用各种精选的商业酵母菌株。目前我国葡萄酒生产上大部分依赖进口葡萄酒酵母,使用方便,品质稳定,但这样的生产方式造成了我国葡萄酒在品种和风格上比较单一,地域特色不突出的特点[5]。产区酵母已经适应了本地的微环境,易于在葡萄酒发酵中占主导地位,而且使用产区酵母酿造葡萄酒可以保证产区的典型特色[4,6]。所以,近几年国内外很多学者均将葡萄酒酵母的研究转向了产区酵母。目前,很多研究者已经通过菌种选育,筛选到了优质的本土酵母[3-8]。攀枝花是四川主要的酿酒葡萄产区,具有得天独厚的发展酿酒葡萄的条件。从攀枝花筛选野生酵母有助于为生产具有四川特色的葡萄酒,提高四川葡萄酒的品质和知名度提供菌种支持。基于此,本实验利用了选择性培养基WL培养基和26s rDNAD1/D2区序列比对,从攀枝花葡萄自然发酵过程中分离了几株野生酿酒酵母,并对其耐受性进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

葡萄 玫瑰蜜和赤霞珠,充分成熟,采自攀枝花仁和区平地镇,用密闭的硬质材料包装,转运回实验室,4℃保存待用。

Bio-rad T100TMPCR仪 美国伯乐公司;DYY-Ⅲ31A/31B型电泳槽、DYY-Ⅲ2型稳压稳流电泳仪 北京六一仪器厂;SX-300型凝胶成像系统 上海四星生物技术有限公司;HZQ-X100A恒温振荡培养箱 昆山一恒仪器有限公司;GY-600-2L全自动高压杀菌机 温州贝诺机械有限公司;全自动蒸汽灭菌锅 上海华线医用核子仪器有限公司;SW-CJ-1F洁净工作台 苏州安泰空气技术有限公司;BT124S电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司;XW-80A漩涡混合仪 上海青葩食品包装机械有限公司。

DNA聚合酶、dNTP 均购自天根生化科技有限公司;DL 5000 DNA ladder、GoldviewTM均购自北京全新拓达生物科技有限公司;6×loading buffer 购自TAKARA公司。

YPD培养基[9]酵母浸粉1.0%、蛋白胨2.0%、葡萄糖2.0%、琼脂2.0%。为了在筛选过程中排除细菌的干扰,在YPD培养基中加100 mg/L的氯霉素;WL培养基[9]配制方法为(按1L计)酵母浸粉4g、胰蛋白胨5g、葡萄糖50g、琼脂20g、储液A40 mL、储液B1 mL,调pH至6.5,灭菌后加储液C1 mL。其中,储液A为磷酸二氢钾5.5g、氯化钾4.25g、氯化钙1.25g、硫酸镁1.25g,定容至400mL。储液B为氯化铁0.25g、硫酸锰0.25g、定容至100mL;储液C 为0.44g溴甲酚绿溶于20mL50%的酒精中;1%琼脂糖凝胶的配制 称取0.2g琼脂糖,置于三角瓶中,加入25mL 1×TBA,将该三角瓶置于微波炉加热至琼脂糖溶解,冷却至50℃左右时加入1μL GoldviewTM核酸染料,充分混匀。

1.2 实验方法

1.2.1 酿酒酵母的分离鉴定

1.2.1.1 酿酒酵母的选择性分离 在超净工作台上无菌称量约100g新鲜成熟度好的葡萄,用无菌纱布包裹破碎后将葡萄汁、葡萄果肉和葡萄皮一起放入无菌的500mL三角瓶,置于27℃恒温培养箱中培养,分别在发酵前期(第1d)、中期(第3d)和后期(第6d)各取发酵液1.0mL,加入9.0mL无菌水中进行梯度稀释至10-7,取0.1mL稀释菌液放入YPD固体培养基,以无菌涂布器涂匀,28℃培养24～48h,挑取单菌落保存[5]。

将分离后的菌落,随机筛选10～15个接种到YPD液体培养基上,活化24h后接种到WL培养基,27℃培养5d后观察,筛选出菌落颜色为奶油色略带绿色、球形突起、表面光滑、不透明、奶油状[5]。

1.2.1.2 酿酒酵母的镜检 对YPD培养基上培养48h后的菌株,以400倍显微镜镜检,筛选出以多端出芽繁殖的菌株[4]。

1.2.1.3 酿酒酵母DNA模板快速制备 挑取复筛后的典型菌株的新鲜菌体于盛有20μL SDS(0.2%)裂解液的1.5mL离心管中,漩涡振荡1min。沸水浴5min后,立即放入-20℃中保存15min,再离心(12000r/min)1min,上清液即为DNA模板。

1.2.1.4 26S rDNA D1/D2区扩增 使用正向引物NL-1:5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′,反向引物NL-4:5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′,进行26S rDNA D1/D2区的扩增。PCR反应体系(30μL)为:1μL DNA模板,正反向引物各1μL,10×buffer 3μL,dNTP 3μL,Taq酶0.5μL,无菌水20.5μL。PCR扩增条件为:94℃ 1min,52℃ 1min,72℃ 1min 30sec,36个循环,4℃保存[9-10]。

1.2.1.5 PCR产物的电泳检测 1%琼脂糖凝胶,5μL Marker(DL 5000),各扩增液5μL,loading buffer 1μL。13V/cm电压电泳15min。若得到条带不纯,则重复扩增步骤。取出胶体,用UVI成像系统拍照。

1.2.1.6 PCR产物测序 将PCR产物送华大基因公司测序。

1.2.1.7 序列比对及系统发育树的构建 将测序获得的26S rDNA D1/D2区核酸序列输入美国国立生物技术信息中心(NCBI)网站的核酸数据库比对系统,利用Blast程序进行比对分析。采用MEGA5.1软件中的neighbor-joining分析法构建系统发育树,并进行1000次Bootstraps检验。

1.2.2 酵母的耐受性研究 对四株分离得到的酿酒酵母进行了如下耐受性研究。

1.2.2.1 渗透胁迫耐受性 依次取OD600为1.0的菌液3μL 100、10-1、10-2、10-3、10-4稀释度的菌液接种于含量为0.8、1.2、1.6、2.0、2.4mol/L的KCl的YPD固体平板上进行生长实验,25℃培养48～72h,观察记录酵母生长状况[2,11]。

1.2.2.2 高温耐受性 依次取OD600为1.0的菌液3μL 100、10-1、10-2、10-3、10-4稀释度的菌液接种于YPD固体平板上并于在37℃和42℃温度条件下培养48～72h,观察记录酵母的生长状况[2]。

1.2.2.3 营养饥饿耐受性 在无菌条件下将OD600为1.0的菌液分别接种到无菌水中,接种量为1%。在25℃条件下分别静置5、6、7、8、9和10d,然后接种到YPD固体平板上进行生长实验,25℃培养48～72h,观察记录酵母生长情况[11]。

1.2.2.4 高糖耐受性 依次取OD600为1.0的菌液3μL 100,10-1,10-2,10-3,10-4稀释度的细胞接种于含量为10%、20%、30%、40%和50%的葡萄糖的YPD固体平板上进行生长实验。在25℃的条件下培养培养48～72h,观察其生长状况[2,10]。

1.2.2.5 酒精耐受性 将活化好的菌种(1.0)接种于酒精含量分别为8%、10%、12%、14%和16%vol的YPD液体培养基中,接种量为1%,28℃培养72h,每8h取样一次,测定其在600nm下的OD值,绘制酵母生长曲线,与未添加酒精所得生长曲线对比,观察其耐受性[12-13]。

1.2.2.6 低pH耐受性 将活化好的菌种(OD600为1.5)分别接种于pH为2.0、2.5、3.0、3.5和4.0 YPD液体培养基(以5mol/L H2SO4调节)中,接种量为1%,28℃培养24h,每3h取样一次,测定其在600nm的OD值,绘制酵母生长曲线,与未调节pH(CK)所得生长曲线对比,观察其耐受性[10]。

2 结果与讨论

2.1 酵母分离

2.1.1 自然发酵中通过YPD培养后的菌落生长情况 自然发酵中接种发酵液到YPD培养基上呈现出稀释度在10-4～10-6各菌落之间的分离度较好,在稀释度为10-7的培养基上很少有菌落出现。

图2 基于26S rDNA序列构建的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree based on 26S rDNA gene sequence

2.1.2 WL营养琼脂培养基和YPD培养基筛选结果 根据WL营养琼脂培养基上和YPD培养基上的生长情况,在自然发酵前期存在的酵母主要是葡萄有孢汉逊酵母。它主要存在于成熟葡萄的浆果表面,不耐酒精,在自然发酵前期会大量存在[14]。在发酵前期未筛选到酿酒酵母,这与薛军侠等[15]的研究结果一致。在发酵中期则主要包括葡萄有孢汉逊酵母、克鲁维毕赤酵母和酿酒酵母;在发酵后期,则主要是酿酒酵母。从发酵中期和后期各挑选出两株具有典型WL培养基形态特征和镜检特征的菌落,分别编号为C1、M1、P3、Z3,4℃斜面保藏待用。

2.1.3 酿酒酵母的26S rDNA D1/D2区序列分析 对保存的4株菌株进行26S rDNA D1/D2区扩增,扩增目的片段长度500～600bp,扩增结果如图1所示。

图1 菌株PCR扩增产物纯化结果Fig.1 Purification results of PCR products注:1为Marker:DL5000 Lander, 2～5分别为:菌株C1、M1、P3、Z3。

由图1可以看出,四株野生酵母的26S rDNA D1/D2区条带大小均在600bp左右,符合预定目标。

四株野生菌株的基因序列的测序结果经blast比对后的结果见表1。测序结果构建的系统发育树,见图2。

表1 四株酵母的26S rDNA D1/D2区比对结果Table 1 Blast results of 26S rDNA D1/D2 region of 4 stains

从表1可以看出,所分离到的四株菌株与酿酒酵母菌株的最大相似度均为100%。从图2构建的系统发育树可以看出,C1、M1、P3、Z3与酿酒酵母标准菌株ATCC 18824的同源性最近,因此将其均鉴定为酿酒酵母。

2.2 酵母耐受性研究

2.2.1 渗透胁迫耐受性 四株菌在不同渗透压YPD平板上生长情况见图3。

图3 四株菌在不同渗透压条件下生长情况Fig.3 Growth performance on different osmotic pressure of the 4 strains

从图3可以看出当KCl浓度为0.8、1.2、1.6mol/L时，四株菌在不同稀释度条件下均能生长,但也存在明显的差异。当KCl浓度达到2.0mol/L时仅有菌液浓度为100可以长出少量菌落,当KCl浓度2.4mol/L时四株菌均不能生长。随着渗透压的升高,会引起细胞内水分活度、细胞质组成均发生显著变化,酵母的细胞膜和菌体内的酶受到破坏,从而影响酵母的生长和发酵[11]。从图3可以看出菌株C1渗透压耐受性最好,菌株Z3耐受性最差。

2.2.2 高温耐受性 四株菌在42℃条件下均不能生长,在37℃时均可正常生长。四株菌在37℃下的生长情况见图4。

图4 四株菌在37℃下生长情况Fig.4 Growth performance on 37℃ of the 4 strains

从图4中可以看出各菌株在浓度为100,10-1,10-2,10-3时生长并无明显差异,当浓度梯度为10-4时各菌株生长状况出现差异。菌株C1菌落生长最好,菌株M1生长最差。酵母适宜的生长温度是22～30℃,温度升高或降低都会影响酵母活性。特别当温度升高时,酵母生长停止。高温会破坏生物分子间的氢键及疏水键,而导致核酸及蛋白质的变性进而影响细胞的代谢活动[16]。葡萄酒生产过程中,使用热浸渍发酵能改善某些葡萄酒的结构和香气,加速反应的进程,减少冷却耗能,提高代谢率,缩短发酵周期。选育优良的耐高温菌株是实现该工艺的前提[2]。

2.2.3 饥饿耐受性 四株菌在25℃条件下静置5～10d后的生长情况见图5。

图5 四株菌饥饿耐受生长情况Fig.5 Growth performance of starvation tolerance of the 4 strains

从图5中可以看出各菌株在无菌水中25℃条件下静置10d依然可以在YPD平板上良好生长,四株菌都表现出良好的饥饿耐受性。随着发酵过程的进行,营养物质的消耗会影响微生物的发酵能力,酿酒酵母对营养饥饿耐受性是葡萄酒工艺生产所要求的良好性质。一般而言,营养饥饿胁迫主要发生在发酵的后期[2]。

2.2.4 高糖耐受性 四株菌在不同浓度的葡萄糖YPD平板上生长情况见图6。

从图6可以看到随着葡萄糖浓度的增加以及菌液稀释度的不同,四株菌的生长发生了明显的变化。当葡萄糖浓度达到30%时,菌液浓度为10-4,菌株P3未能生长出菌落,其他三菌株都长出了少量菌落。当葡萄糖浓度达到40%时菌株Z3仅在菌液浓度为100能生长,其他三株菌的浓度为10-2时仍能生长出少量菌落。当葡萄糖浓度50%时四株菌均不能生长。葡萄酒工业中,糖是酒精发酵的基质,也是酵母赖以生存的营养物质。但是高浓度的糖对酵母具有抑制作用——葡萄糖阻遏和葡萄糖抑制作用。而且,高的渗透压会导致酵母细胞水分流失,活性降低。此外,培养基中糖浓度较高时,系统粘度较高,CO2释放缓慢，影响其生长和发酵的进行[2]。从图6可以看出菌株M1和P3高糖耐受性相对最好,菌株Z3最差,但对于一般的12°干酒(20%含糖量)来说,四株菌均能耐受对应含糖量。

图6 四株菌在不同浓度葡萄糖中生长情况Fig.6 Growth performance on different content of glucose of the 4 strains

2.2.5 酒精耐受性实验 四株菌在不同浓度酒精的YPD液体培养基中生长曲线见图7。

图7 四株菌不同酒精浓度条件下生长曲线(n=3)Fig.7 Growth curves in different content of acohol of the 4 strains(n=3)

从图7中可以看出,随着乙醇浓度的增加,酵母菌株的延滞期均有所加长甚至出现生长停滞的现象。当乙醇浓度为12%时,虽然延滞期很长但菌株在30h后其OD600值均表现出不同程度的增长。其中菌株Z3增长速度最为缓慢,菌株M1增长最快。当乙醇浓度达到14%及以上时,四株菌生长均发生停滞。在实际的生产发酵过程中,随着发酵的进行营养物质不断被消耗,同时酒精的浓度逐渐升高。酵母对酒精的耐受性直接关系到发酵是否彻底、是否完全以及营养物质的充分利用与否。

2.2.6 低pH耐受性实验 四株菌在不同pHYPD液体培养基中生长曲线见图8。

图8 四株菌在不同pH条件下的生长曲线(n=3)Fig.8 Growth curves in different pH of the 4 strains(n=3)

从图8可以看出,随着pH的降低,四株酵母的生长都受到了不同程度的抑制,当pH为2时,四株酵母均无明显的生长现象。当pH为2.5及以上时,四株酵母均可以生长,但与YPD相比,随着pH的降低,酵母的生长受到了不同程度的影响,表现为迟滞期延长,最大OD600减小,其中尤以pH2.5的影响最大。葡萄汁的pH通常在2.75～4.25之间[17]。较低的pH可以抑制杂菌的生长,同时也是葡萄酒风味形成的原因之一。从图8可以看出,四株菌均满足葡萄酒生产时葡萄汁的pH要求。

3 结论

本研究通过鉴别WL营养培养基及YPD培养基上菌落形态特征,成功分离到攀枝花葡萄在自然发酵中的酿酒酵母菌株,结合酵母26S rDNA D1/D2区序列比对,确认筛选出的四株酵母均为酿酒酵母。从耐受性来看,四株酵母菌株对考察的胁迫条件的耐受性存在一定的差异:四株酵母菌均能耐受2.0mol/L KCl的渗透压,不能耐受2.4mol/L KCl的渗透压,其中菌株C1渗透压耐受性最好,菌株Z3最差;四株酵母菌均能耐受37℃的高温,均不能耐受42℃,其中菌株C1高温耐受性最好,菌株M1最差;四株酵母菌均表现出良好的饥饿耐受性;四株酵母菌均能耐受40%的高糖浓度,其中耐受性最好的为M1,最差的为Z3。四株酵母菌均表现出良好的耐低pH性;四株酿酒酵母均能耐受12%的酒精浓度,不能耐受14%及以上的酒精浓度,其中菌株M1对酒精耐受性最好,菌株Z3最差。综上所述,菌株C1渗透压耐受性、高温耐受性好于其他三株菌,同时具有优良的饥饿耐受性、耐低酸性。菌株M1高糖耐受性、酒精耐受性好于其他三株菌,同时具有优良的饥饿耐受性、耐低酸性。菌株C1和M1在实验的四株菌中耐受性相对较好。

通过耐受性实验选育出的菌株C1和M1为生产具有四川地域特色的葡萄酒提供了初步的实验菌株。耐受性好的菌株并不意味着一定能生产出优质的葡萄酒,下一步工作将对C1和M1进行发酵性能的研究,并采用真实葡萄进行发酵工艺的研究。

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Stress tolerances of four wild yeast strains

LIU Xing-yan,PAN Jun,GU Yi-hong,LEI Zhi,LAN Hao,AO Xiao-lin,LUO Chao

(College of Food Science,Sichuan Agricultural University,Ya’an 625014,China)

Saccharomycescerevisiaeis critical for flavor formation during wine production. Native strains could keep regional characters of wine,avoid indentical variety and style. Four nativeS.cerevisiaestrains were successfully isolated from spontaneously fermenting must fromPanzhihuawith Wallerstein Laboratory Nutrient Agar(WL),and the strains were characterized with micro-morphological observation and 26S rDNA D1/D2sequencing. Stress tolerances of the 4 selectedS.cerevisiaestrains were studied,including responses to high osmotic pressure,high temperature,nutrient starvation,high concentrations of sugar and ethanol,and low pH. Differences were found in their tolerance ability,and strains C1and M1were comparatively better among these strains.

wine;Saccharomycescerevisiae;isolation;identification;tolerance

2014-04-02

刘兴艳(1979-),女,硕士,副教授,研究方向:果品贮藏与加工。

四川省教育厅自然科学类重点项目——攀枝花葡萄酒野生酵母的筛选及发酵特性研究(12ZA122)。

TS261.1

A

1002-0306(2015)01-0149-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.023