施元洪刘镇峰李镇波陈玉兴

1.汕头大学医学院第一附属医院药剂科，广东汕头515041；2.广东省汕头市皮肤性病防治院药剂科，广东汕头515041；3.广东省汕头市濠江区河浦人民医院药剂科，广东汕头515098；4.广东省中医研究所中药室，广州515000

高效液相色谱法测定复方清肺饮颗粒中淫羊藿苷的含量研究

施元洪1刘镇峰2李镇波3陈玉兴4

1.汕头大学医学院第一附属医院药剂科，广东汕头515041；2.广东省汕头市皮肤性病防治院药剂科，广东汕头515041；3.广东省汕头市濠江区河浦人民医院药剂科，广东汕头515098；4.广东省中医研究所中药室，广州515000

目的建立用高效液相色谱法（HPLC）测定复方清肺饮颗粒中淫羊藿苷含量的方法。方法采用C18色谱柱（200mm×4.6mm，5μm三津特纳）；流动相：乙腈-水（30∶70）；检测波长：270 nm。考察供试品和（或）对照品溶液的线性关系，HPLC的精密度、稳定性、重复性以及加样回收率试验和样品测定。结果淫羊藿苷在4～36μg/ml（r=0.9998）范围内有良好的线性关系。平均回收率为98.11%，RSD为2.55%。结论采用HPLC测定复方清肺饮颗粒中淫羊藿苷含量操作方法简便、准确、灵敏度高，重复性好，可有效地用于复方清肺饮颗粒的质量控制。

复方清肺饮颗粒；淫羊藿苷；高效液相色谱法

复方清肺饮颗粒是本医院的中药自制制剂，组方：金银花、黄芩、连翘、淫羊藿、紫花地丁、桔梗、枇杷叶、桑白皮等。临床上用于治疗肺、胃热盛型的痤疮、脂溢性皮炎等症，效果确切。该方药味众多，成分复杂，其性质各不相同，为保证本制剂的科学性和质量稳定，本文采用高效液相色谱法对复方清肺饮颗粒方中主药之一淫羊藿的主要有效成分——淫羊藿苷的含量进行测定，结果准确可靠。

1 仪器与试药

1.1 仪器

JASCO 2000高效液相色谱仪（日本分光株式会社）；岛津LC-10ATVP泵；ME5型精密电子分析天平（瑞士梅特勒．托利多公司）；ANASTAR色谱数据系统（美国TS公司）；BRANSO NSB3200超声波清洗器；Sartorius PH酸度计（德国塞多利斯公司）；HH-S型水浴锅（巩义市英峪予华仪器厂）；SK 5200H型超声波提取机（中国科导超声仪器有限公司制造）。

1.2 试药

淫羊藿苷对照品（中国药品生物制品检定提供，供含量测定用），复方清肺饮蓝颗粒为广东省汕头大学医学院第一附属医院自制，所用药材均为生产用同批药。乙腈均为色谱纯（CALEDON LABORATOR IESLTD．Canada），水为重蒸馏水，乙醇及其他试剂均为分析纯。

1.3 检测方法

1.3.1 色谱条件

采用C18色谱柱（200mm×4.6mm，5μm三津特纳），流动相：乙腈-水（30∶70）；流速：1.0 ml/min，检测波长为270 mm；柱温：25℃；进样量：20μl。

1.3.2 溶液的制备

1.3.2.1 淫羊藿对照品配制精密称取淫羊藿苷对照品，加75%乙醇溶液制成1.31mg/ml的对照品溶液[1]。精密吸取对照品溶液5μl，注入液相色谱仪。保留时间（Rt）=7.966 min，分离度（Rs）=10.78。

1.3.2.2 供试品溶液的制备精密称取复方清肺饮颗粒内容物1 g，置于锥形瓶中，精密称定，精密加入75%乙醇溶液50 ml，密塞，称定重量，超声提取30 mim，放冷，再称定重量，用乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取连续滤液15 ml，用75%乙醇溶液定容于25ml容量瓶中，即得。精密吸取供试品溶液5μl，注入液相色谱仪[2]。Rt=8.111min，Rs=8.17。

1.3.3 标准曲线的绘制精密称取淫羊藿苷对照品1.4mg，置50ml容量瓶中，加75%乙醇溶液溶解并稀释至刻度，精密吸取该溶液1、3、5、7、9ml置25ml容量瓶中，加75%乙醇溶液配制成浓度为2.8、5.6、11.2、22.4、28.0μg/ml的对照品溶液，按“1.3.1”项下色谱条件进样，测定峰面积积分值，以峰面积为纵坐标，相应浓度为横坐标进行性回归，得回归方程为A=27569．38C+ 6275．3（r=0.9998），线性范围为4～36μg/m1。

2 结果

2.1 精密度试验

按“1.3.2.2”供试品溶液的制备方法进行样品采集。吸取溶液20μl，按“1.3.1”项下色谱条件进样，色谱条件重复进样6次，测定淫羊藿苷色谱峰面积积分值，结果RSD=1.02%（n=6）（表1）。

表1 淫羊藿苷样品精密度试验结果

2.2 稳定性试验

精按“1.3.2.2”供试品溶液的制备方法进行样品采集。按“1.3.1”项下色谱条件进样，色谱条件于0、1、2、4，8、16、24 h时，分别进样20μl，测定淫羊藿苷峰面积积分值，RSD=1.02%（n=7），结果表明，样品溶液在24 h内稳定（表2）。

表2 淫羊藿苷样品稳定性试验结果

2.3 重现性试验

取同一批样品（批号：20130413），按“1.3.2.2”供试品溶液的制备方法进行样品采集，按“1.3.1”项下色谱条件进样，色谱条件平行测定6次，结果，平均含量为769．56μg/g，RSD=1.17%（表3）。

表3 淫羊藿苷样品重现性试验结果

2.4 加样回收率试验

准确称取已知含量的样品适量，并准备加入一定量的淫羊藿苷对照品，按“1.3.2.2”供试品溶液的制备方法进行样品采集，按“1.3.1”项下色谱条件进样，测定峰面积积分值，计算回收率，样品中淫羊藿苷的含量测定结果见表4。

表4 样品中淫羊藿苷的加样回收率试验结果

2.5 样品含量测定

精密称取4批样品各1 g，按“1.3.2.2”供试品溶液的制备方法进行样品采集，即得制成供试品溶液，按“1.3.1”项下色谱条件进样，分别测定淫羊藿苷含量，结果见表5。

表5 样品含量测定结果

3 讨论

复方清肺饮颗粒药味众多，成分复杂，其性质各不相同。方中淫羊藿的主要成分为淫羊藿苷，相关研究表明，淫羊藿苷对家兔有降低外周阻力和较缓和的降压作用，还能提高肾上腺皮质功能。为保证本制剂的科学性和质量稳定，本文根据《中国药典》（2005年版·一部）采用高效液相色谱法对复方清肺饮颗粒方中主药之一淫羊藿的主要有效成分——淫羊藿苷的含量进行测定。目前高效液相色谱法已逐渐成为中药检验的最重要分析手段，在中药及天然药物有效成分含量测定中发挥日益重要的作用[3-4]，对于其药效、药理学的研究具有重要意义，但尚不能全面而准确地反映附子药材中的精确药效成分[5]。曾试过乙腈-水（25∶75）作为流动相，结果淫羊藿苷与邻近峰分离不理想，最后改用高效液相色谱法测定复方清肺饮颗粒中淫羊藿苷含量，本方法峰形对称，且分离度较好。实验结果显示，淫羊藿苷在4～36μg/ml范围内有良好的线性关系（r=0.9998）。平均回收率为98.11%，RSD为2.55%。在提取方法的选择方面，则选用目前通用的标准方法，即根据淫羊藿的性质进行提取。在线性关系考察、精密度实验、稳定性试验、重复性试验、加样回收率试验和样品测定等方面，本研究结果与类似文献[6-15]研究水平基本一致。

综上所述，高效液相色谱法能够较好地分离淫羊藿中的淫羊藿苷成分，高效液相色谱法操作简便、分离效果好，重现性高、结果准确可靠，具有实际应用意义。

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Content study of icariin in com pound qingfeiyin granule determ ined by high performance liquid chromatography

SHIYuan-hong1LIU Zhen-feng2LIZhen-bo3CHEN Yu-xing4
1.Department of Pharmacy,the First Affiliated Hospital of Shantou University Medical College in Guangdong Province, Shantou 515041,China;2.Department of Pharmacy,Prevention and Treatment Hospital of Skin Venereal Disease of Shantou City in Guangdong Province,Shantou 515041,China;3.Department of Pharmacy,Hepu People′s Hospital in Haojiang District of Shantou City in Guangdong Province,Shantou 515098,China;4.Room of Chinese Materia Medica, Guangdong Institute of Traditional Chinese Medicine,Guangzhou 515000,China

Objective To establish themethod of determining icariin content from compound qingfeiyin granule by high performance liquid chromatography(HPLC).M ethods C18chromatographic column(200 mm×4.6 mm,5μm three jin turner)was applied.Themobile phase was acetonitrile and water in ratio of 30 to 70.The detection wavelength was 270 nm.The linear relation of test samples solution and(or)reference sample solution was observed.The precision,stability, and repeatability of HPLC,added recovery rate test,and sample determination were also observed.Results Icariin had a good linear relation ranging from 4μg/ml to 36μg/ml(r=0.9998).The average recovery rate was 98.11%,and relative standard deviation(RSD)was 2.55%.Conclusion Operational approach of content determination of icariin in compound qingfeiyin granule by HPLC is simple and accurate with high sensitivity and good repeatability,it can be effectively used in quality control of compound qingfeiyin granule.

Compound qingfeiyin granule;Icariin;High performance liquid chromatography

R927.2

A

1674-4721（2015）04（c）-0007-03

2014-12-24本文编辑：许俊琴）

广东省汕头市医疗科技计划项目（汕府科[2013] 88号）