胡晓琴，邱 皓△，吕晓云，刘 文，李艳芬，滕玉莲，陶小红

1甘肃省第二人民医院，甘肃 兰州 730000；2兰州大学

康肾合剂对酒精性肾损害大鼠肾组织NF-κB活化及IL-6水平的影响*

胡晓琴1，邱 皓1△，吕晓云2，刘 文1，李艳芬1，滕玉莲2，陶小红1

1甘肃省第二人民医院，甘肃 兰州 730000；2兰州大学

目的：探讨中药康肾合剂(KSP)对酒精性肾损害模型大鼠肾组织核转录因子κB(NF-κB)活化及白细胞介素6(IL-6)水平的影响。方法：将SD雄性大鼠66只随机分为正常组、酒精组、中药组各22只。正常组给予生理盐水灌胃，酒精组给予无水乙醇每日2次灌胃，中药组在给予同酒精组等量乙醇基础上，加用KSP水煎剂每日2次灌胃，共12周。于实验第4周、8周、I2周末采用免疫组化法及ELISA法检测肾组织NF-κB活化及IL-6水平变化。结果：酒精组大鼠肾组织NF-κB活化较正常组显著上调，IL-6水平明显上升(P＜0.05)；中药组NF-κB活化及IL-6水平明显低于酒精组(P＜0.05)。结论：KSP干预酒精性肾损害的作用机制可能与其抑制NF-κB活化、降低IL-6水平有关。

酒精性肾损害；康肾合剂；核转录因子κB；白细胞介素6

过量饮酒是世界范围内的一个重要公共卫生问题。相关研究证实，乙醇可诱发以肾小管-间质损害为主的肾脏病理改变，其结果可进展至肾间质纤维化、慢性肾功能衰竭［1］。本课题组以往研究发现，复方中药活血利湿方对大鼠酒精性肾损害具有良好的干预作用［2］。本研究在建立酒精性肾损害动物模型的同时，以复方中药康肾合剂(Ka n g s h e n P rescr ip t i o n，K S P)灌胃，研究K S P对酒精性肾损害模型大鼠肾组织核转录因子κB (N F-κB)活化及血清白细胞介素6(I L-6)水平的影响，进一步探讨K S P干预酒精性肾损害的可能机制，为K S P临床应用提供新的实验室依据。

1 材料与方法

1.1 材料 无水乙醇(分析纯，沈阳化学试剂厂)；小鼠抗大鼠N F-κB p65多克隆抗体(美国S a n ta C r u z公司，武汉博士德生物工程有限公司分装)；免疫组化检测试剂盒 (武汉博士德生物工程有限公司提供)；大鼠I L-6 E L I S A试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司提供)；K S P药物组成：黄芪50g，当归20 g，枸杞子20 g，红花15 g，连翘20 g，白茅根30 g，薏苡仁30 g。药物均购自甘肃省药材公司，经鉴定符合国家药典标准。加5倍体积水，煎30分钟，同法煎煮2次，2次煎煮药液混合(含生药2.6 g/m L)，冷藏备用，采用高效液相控制药物质量。

1.2 动物分组、模型复制及给药方法 清洁级S D雄性大鼠66只，体质量(180±20)g，由兰州大学医学实验动物中心提供(甘动准14-006)。动物分组、模型复制及给药方法参照文献［2］方法进行。

1.3 免疫组织化学染色(SP)法 分别取灌胃4周末、8周末、12周末正常组大鼠各6只及酒精组、中药组各8只，断头处死，迅速摘取肾脏，制备肾组织切片。切片经常规脱蜡水洗，3%H2O2封闭内源性过氧化物酶，微波抗原修复，加小鼠抗大鼠N F-κB p65多克隆抗体一抗(1∶75)，标本置湿盒内4℃过夜，滴加生物素化羊抗兔二抗I g G(1∶100)，滴加辣根过氧化物酶标记链霉素卵白素，D A B显色，苏木精复染细胞核，常规脱水，透明，中性树胶封片。以P B S代替一抗作阴性对照，以博士德公司提供的扁桃腺切片作阳性对照。每鼠6张切片。应用彩色病理图文分析系统，通过光学显微镜放大400倍摄取图像，输入图像分析系统内，分别进行肾小球与肾小管中N F-κB活化检测：每张切片随机选取5个肾小球，计算每个肾小球中染色区域面积占整个肾小球面积的百分比，以均值表示每例肾小球中阳性信号面积；计算每张切片皮质区60个高倍视野下阳性小管数与总肾小管数的百分数，以均值表示每例肾小管中的阳性率。

1.4 ELISA法检测IL-6 分别于灌胃4、8、12周末处死动物，留取肾脏，制备肾组织匀浆，参照试剂盒说明书进行检测。另取上清液，采用美国P i erce公司蛋白分析试剂盒测定上清液蛋白含量。结果判定：肾组织I L-6蛋白含量(n g/g)=肾组织匀浆上清液I L-6浓度(n g/L)/组织匀浆上清液蛋白定量(g/L)。

1.5 统计学方法 数据采用S P SS 13.0统计学软件进行处理，计量资料以(±s)表示，组间比较采用方差分析，组间多重比较采用L S D-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 KSP对酒精性肾损害模型大鼠肾组织NF-κB活化的影响 镜下胞浆或胞核出现棕黄色颗粒，表明存在肾组织N F-κB活化。正常组可见少部分肾小球系膜细胞和远端肾小管上皮细胞有微弱N F-κB活化；酒精组肾小球系膜细胞、髓质区肾小管上皮细胞和集合管有较强活化，活化信号位于胞浆及胞核核周；中药组肾组织中N F-κB活化信号低于酒精组(P＜0.05)，见表1。

2.2 KSP对酒精性肾损害模型大鼠肾组织IL-6水平的影响 随着酒精刺激时间的延长和剂量的不断加大，酒精组I L-6水平较正常组升高(P＜0.05)，与酒精组比较，中药组I L-6显著降低，接近正常组(P＜0.05)，见表2。

表1 肾组织中NF-κB活化情况(±s) %

表1 肾组织中NF-κB活化情况(±s) %

注：与正常组比较，△表示P＜0.01；与酒精组比较，#表示P＜0.05,##表示P＜0.01。

组别例数 4周 8周 12周肾小球 肾小管 肾小球 肾小管 肾小球 肾小管正常组 18 1.52±0.42 7.32±2.19 1.63±0.48 8.24±4.51 1.69±0.47 8.36±2.65酒精组 24 15.24±4.53△37.63±10.32△31.28±8.19△54.38±14.28△46.71±14.78△69.85±8.23△中药组 24 9.72±2.62#24.36±7.09#13.18±3.76##28.14±7.51##14.67±4.92##29.36±8.65##

表2 肾组织IL-6水平变化情况(±s) ng/g

表2 肾组织IL-6水平变化情况(±s) ng/g

注：与正常组比较，△表示P＜0.01；与酒精组比较，#表示P＜0.05,##表示P＜0.01。

组别 例数 IL-6 4周 8周 12周正常组 18 325.64±83.12 336.72±92.34 338.69±91.81酒精组 24 413.57±112.73△442.85±113.45△462.27±121.68△中药组 24 382.16±102.43#375.36±108.15##347.81±89.27##

3 讨论

业已证实，炎症反应与酒精性肾损害密切相关。N F-κB是真核细胞基因转录中重要的因子。活化的N F-κB可诱导多种炎症性细胞因子、趋化因子(如I L-6、M C P-1)、细胞黏附分子及细胞外基质成分等的基因表达，参与肾损害的发病过程［3］。因此，N F-κB作为上游调控因子，在酒精性肾损害的发生发展过程中起至关重要作用，而抑制N F-κB活性，可从基因水平上抑制肾损害［4］。I L-6在肾小球硬化、肾小管萎缩和肾间质纤维化的过程中起重要促进作用，可诱导上皮细胞其他细胞因子的表达，从而催化和放大炎症反应。在多种肾脏疾病中，I L-6可促进其发展，其在肾脏中的高表达与肾小球系膜增生、肾小管萎缩呈正相关［5］，其分泌与M C P-1的调控有关［6］。本研究结果显示，随着酒精负荷时间的延长，大鼠肾组织N F-κB活化逐渐增强，活化的N F-κB主要表达于肾小管上皮细胞和间质细胞，仅有少量表达于肾小球固有细胞，并伴随肾功能损害，此与相关文献报道一致［7］。尤以肾小管为著，同时伴随血清I L-6的升高。经K S P灌胃干预后，N F-κB表达明显减弱，其下游炎症相关因子I L-6水平亦显著降低。结合本课题组以往研究［8］，认为复方中药K S P(同活血利湿方)正是通过N F-κB信号通路，下调M C P-1、I L-6的表达，达到抑制酒精性肾损害的目的。

中医学认为，酒辛而温热，少则鼓舞气血，通畅经络，有助气机，多则酿湿生痰，久而导致气滞血瘀。湿瘀互结，久羁体内，必伤气血，变证百出，表现为正虚(气、血)邪实(瘀、湿)之病机。K S P方中黄芪、当归、枸杞益气养血；当归、红花活血化瘀，连翘、白茅根、薏苡仁清利湿热，合奏扶正祛邪之功。国内研究证实，黄芪、当归等补益药为主组成的复方以及化瘀解毒类中药复方具有明显的抗肾纤维化作用［9-11］。本研究结果提示，K S P在减轻酒精造成的肾脏病理损害的同时［2］，可通过N F-κB、I L-6等靶点而发挥干预酒精性肾损害的作用，显示出良好的抗酒精性肾纤维化潜能。

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Effectsof KangShen Prescription on the NF-κB Activation and IL-6 Level in Ratsw ith Alcoholic RenalDam age

HU Xiaoqin1,QIU Hao1△,LYU Xiaoyun2,LIUWen1,LIYanfen1,TENG Yulian2,TAO Xiaohong1
1 The Second People′s Hospital of Gansu Province,Lanzhou 730000,China; 2 Lanzhou University

Objective:To study the effectof KangShen prescription(KSP)on the activation of nuclear factor kappa-B (NF-κB)and the levelof Interleukin 6(IL-6)in ratsofalcoholic renaldamage.Methods:The66male SD ratswere randomized into normal,alcoholic and Chinesemedicalgroupsw ith 22 cases in each.The normal salines were given to the ratsof normalgroup by gavage,the ethanol for tw ice a day to the ratsof alcoholic group and KSP based on the ethanolequal to the amountof the alcoholic group to the rats of Chinesemedicalgroup for tw ice day, w ith 12 weeks course.At the end of 4th,8th and 12th week,the NF-κB activation and IL-6 levelswere determined by immunohistochemical and ELISA methods.Results:Compared w ith the normal group,the activation of NF-κB and the level of IL-6 in rats renal tissues of alcoholic group significantly wentup(P＜0.05);those in the Chinese medicalgroup weremarkedly lower than in thealcoholic group(P＜0.05).Conclusion:KSP intervention for patients w ith alcoholic kidney damagemay be relevant to its functions in inhibiting the activation of NF-κB and decreasing the levelof IL-6.

alcoholic renaldamage;Chinesemedicine;KSP;NF-κB;IL-6

R965

A

1004-6852(2015)03-0011-03

2014-01-30

2011年甘肃省自然科学基金项目(编号1007RJZA085)

胡晓琴(1968—)，女，主治医师。研究方向：儿童肾病的诊治。

△通讯作者：邱皓(1966—)，男，主任医师。研究方向：肾内科疾病的中西医结合治疗。