张 静，高 洁，武莎斐，鲁 涛，梁智勇

中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院病理科，北京100730

肾上腺嗜酸细胞型皮质癌的临床病理特征及表皮生长因子受体基因状态

张 静，高 洁，武莎斐，鲁 涛，梁智勇

中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院病理科，北京100730

目的 探讨肾上腺嗜酸细胞型皮质癌临床病理特征及其表皮生长因子受体 (epidermal growth factor receptor，EGFR)蛋白表达、基因突变和基因拷贝数改变情况。方法 回顾性分析2000年1月至2009年12月在北京协和医院手术切除的9例肾上腺嗜酸细胞型皮质癌的临床特点、组织形态学特征，并以9例肾上腺嗜酸细胞型皮质腺瘤为对照，应用免疫组织化学、Scorpion ARMS突变系统及荧光原位杂交 (fluorescence in situ hybridization，FISH)的方法分析EGFR在二者中的蛋白表达、基因突变和基因拷贝数改变的情况。结果 9例肾上腺嗜酸细胞型皮质癌中，Cushing综合征2例，无功能性皮质癌7例。病例随访时间6～56个月，皮质癌患者失访2例，死亡6例。肾上腺嗜酸细胞型皮质癌中EGFR蛋白过表达率为77.8%(7/9)，EGFR FISH阳性率为55.6% (5/9);仅有22.2% (2/9)皮质腺瘤存在EGFR蛋白的表达，且EGFR FISH均为阴性。肾上腺嗜酸细胞型皮质腺瘤及皮质癌中均未检测出EGFR基因扩增及基因突变。结论 肾上腺嗜酸细胞型皮质癌非常罕见，其诊断依据病理学及免疫表型，EGFR蛋白过表达和7号染色体的高多体性较腺瘤更常见，可能有助于与后者的鉴别诊断，也有可能成为今后临床分子靶向治疗的潜在方向。

肾上腺嗜酸细胞型皮质癌;表皮生长因子受体;免疫组化;荧光原位杂交;基因突变

Med J PUMCH，2015，6(3):191－196

肾上腺皮质癌是起源于肾上腺皮质的少见恶性上皮性肿瘤，而嗜酸细胞型皮质癌 (adrenocortical oncocytic carcinoma)是其中一个非常罕见的亚型，迄今为止国外报道26例［1-8］，国内报道仅10例［9-10］，多以个案报道居多，临床对该病认识尚不足，且对于该类肿瘤的分子遗传学研究也甚少。近年来研究表明表皮生长因子受体 (epidermal growth factor receptor，EGFR)在肺癌、胰腺癌、膀胱癌、卵巢癌、宫颈癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤中过表达，且与不良预后相关［11-12］。肾上腺皮质癌中 EGFR基因状态鲜有报道［13-14］，目前尚未见研究报道肾上腺嗜酸细胞型皮质癌中EGFR基因状态。本研究回顾性纳入北京协和医院10年间手术切除并经病理证实为肾上腺嗜酸细胞型皮质癌患者9例，总结其临床特点、组织形态学特征，并应用免疫组化、Scorpion ARMS突变系统及荧光原位杂交 (fluorescence in situ hybridization，FISH)的方法分析EGFR在该类肿瘤中的蛋白表达、基因突变和基因拷贝数改变情况，以提高对其认识。

材料和方法

标本来源

2000年1月至2009年12月在北京协和医院经手术切除的肾上腺皮质肿瘤共989例，由有经验的病理医师重新阅片审核证实为肾上腺嗜酸细胞型皮质癌9例，选取同时期9例嗜酸细胞型皮质腺瘤作为对照。查阅病例资料，收集包括年龄、性别、手术信息、组织学特征、临床分期及预后等信息。

免疫组织化学染色

手术切除标本均由中性福尔马林固定，石蜡包埋，4 μm涂胶切片。EGFR染色采用DAKO EGFR pharmDxTM试剂盒，操作步骤参照使用说明书，主要反应步骤:室温0.3%H2O2孵育10 min，蛋白酶K抗原修复5 min，一抗湿盒中室温孵育70 min，二抗同条件下孵育45 min。免疫组化判读标准:＞10%的肿瘤细胞出现棕黄色胞膜着色定义为阳性，根据阳性细胞的比例和强度记录为:弱阳性+，中度阳性++，强阳性+++。

基因突变检测

使用英国Dlivering Pharmacogenomics公司推出的EGFR突变检测试剂盒 (EGFR Scorpion Kit)。该试剂盒针对外显子第18、19、20和2l的常见突变类型设计了9组检测探针，同时设计相应的基因野生型检测探针，可以检测29种EGFR突变。使用ABI 7500 PCR仪进行即时PCR扩增，PCR条件为95℃变性10 min; 95℃30 s，61℃1 min，循环40次。反应结束后即时PCR仪自动以扩增曲线的形式输出结果。结果根据EGFR突变检测试剂盒的使用说明书进行判读。

荧光原位杂交检测

石蜡预处理试剂盒Ⅱ及EGFR检测探针LSI EGFR Spectrmn Orange/CEP Spectrum Green均购自 Vysis公司。FISH主要步骤:(1)石蜡切片56℃烤片过夜，常规脱蜡，预处理溶液中80℃处理10 min，蛋白酶溶液中消化15 min，依次经75%、85%和90%乙醇脱水后自然干燥;(2)取10μl探针混合液滴于切片组织上;(3)次日取出标本，去除橡胶水泥，在2×SSC/ 0.3%NP40洗脱液中73℃洗涤3 s，再于室温下洗涤5 s，自然干燥;(4)DAPI对比染色，在 Olympus BX51荧光显微镜下通过特异性滤光片观察，计数，应用VideoTest软件进行图像合成分析。结果判读:根据Cappuzzo等［15］的标准进行结果判断，随机计数60个肿瘤细胞。EGFR为红色信号，7号染色体着丝粒为绿色信号，计算红色信号和绿色信号比值，高多体性(high polysomy)和基因扩增 (gene amplification)为FISH阳性，而二体性 (disomy)、低三体性 (low trisomy)、高三体性 (high trisomy)、低多体性 (low polysomy)为FISH阴性。

结果

临床资料

研究期间肾上腺嗜酸细胞型皮质癌病例占同期连续收治的肾上腺皮质肿瘤病例的0.9% (9/989)。肾上腺嗜酸细胞型皮质癌患者中，男性3例，女性6例;平均年龄为42.9岁。多数肿瘤位于右侧，仅1例发生在左侧;大部分为无功能性皮质癌，有2例患者临床上表现为Cushing综合征。经随访观察，4例患者发生腹壁、肾脏、脾脏等器官的转移。病例随访时间6～56个月，2例患者失访，余患者多数预后不良，6例患者在术后12～48个月后死于肿瘤，另1例患者术后32个月尚存活 (表1)。

肾上腺嗜酸细胞型皮质癌大体及镜下观察

肿瘤多数体积较大，呈结节状，最大直径4～ 21 cm，常有包膜，仅少数与周围组织境界不清，切面呈棕黄色或多彩状，质较软，常伴出血、坏死、纤维化瘢痕，可有囊性变及钙化。大部分肿瘤细胞体积大，呈多角形，大多呈嗜酸性，透明细胞稀少或全无，细胞核有不同程度的异型性，可见明显核仁，核分裂象多少不等，可见瘤巨细胞 (图1)。少部分区域瘤细胞呈梁状或巢状排列，其间可见丰富的血窦，但大部分呈弥漫分布，部分病例脉管内可见瘤栓。肿瘤细胞可浸润包膜、周围脂肪及神经组织 (表2)。

图1 肾上腺嗜酸细胞型皮质癌细胞呈弥漫分布，核异型性明显，胞质嗜酸性，可见核分裂 (HE，×100)

表1 9例肾上腺嗜酸细胞型皮质癌临床特点

表2 9例肾上腺嗜酸细胞型皮质癌病理组织学特征

EGFR在肾上腺嗜酸细胞型皮质癌及腺瘤中蛋白表达、基因突变和基因拷贝数改变情况

EGFR蛋白在7例肾上腺嗜酸细胞型皮质癌中呈中-强的胞膜着色 (7/9，77.8%)(图2)，2例呈阴性;仅2例肾上腺嗜酸细胞型皮质腺瘤呈弱的胞膜着色 (2/9，22.2%)，余7例均为阴性。EGFR在嗜酸细胞型皮质癌中的表达率及表达强度均明显高于腺瘤 (表3)。

9例肾上腺嗜酸细胞型皮质癌及9例嗜酸细胞型皮质腺瘤均未显示 EGFR扩增，但5例皮质癌 (5/9，55.6%)显示高多体性 (图3)，2例 (2/9，22.2%)呈低三体性，余2例 (2/9，22.2%)为二体性;然而，皮质腺瘤未显示高多体性，2例 (2/9，22.2%)呈低多体性，2例 (2/9，22.2%)呈二体性，余5例示 (5/9，55.6%)呈低三体性 (表3)。与皮质腺瘤相比，皮质癌中EGFR高多体性更常见。皮质癌EGFR FISH阳性率为55.6%(5/9)，皮质腺瘤EGFR FISH均为阴性。

本组病例中均未发现EGFR外显子18～21的突变，所有嗜酸细胞型皮质癌及腺瘤均显示野生型(图4)。

图2 表皮生长因子受体在肾上腺嗜酸细胞型皮质癌中呈强阳性 (+++)，肿瘤细胞膜呈棕黄色 (免疫组织化学，×100)

表3 表皮生长因子受体在肾上腺嗜酸细胞型皮质癌及腺瘤中蛋白表达、基因突变和基因拷贝数改变情况

图3 肾上腺嗜酸细胞型皮质癌中表皮生长因子受体基因拷

图4 肾上腺嗜酸细胞型皮质癌中未检测到表皮生长因子受体突变，红色曲线代表阳性对照

讨论

肾上腺皮质肿瘤中最常见为皮质腺瘤，而肾上腺皮质癌尤其是嗜酸细胞型皮质癌甚为罕见，回顾国内外文献至今报道共不足40例，且对于该类肿瘤的分子遗传学研究也甚少，本研究收集了本院9例肾上腺嗜酸细胞型皮质癌，总结其临床病理学特征，并分析了EGFR在该类肿瘤中的蛋白表达、基因突变和基因拷贝数改变的情况。

肾上腺嗜酸细胞型皮质癌的诊断，关键在于其良恶性鉴别。根据Weiss系统，具备以下4个或4个以上条件即可诊断肾上腺皮质癌:细胞核异型性大，＞75%瘤细胞有嗜酸性胞浆，＞33%弥漫结构，有坏死，核分裂 ＞5/50高倍视野 (high power fields，HPFs)，有异常核分裂、包膜侵犯、血管侵犯及窦隙侵犯［16］。该系统主要针对肾上腺系统非嗜酸性肿瘤，因为多数嗜酸细胞型皮质肿瘤具有细胞核异型性大，＞75%瘤细胞有嗜酸性胞浆，＞33%弥漫结构的特点。2004年Bisceglia等［4］对Weiss系统进行修订，提出新的评分标准，建议:(1)在嗜酸细胞型皮质肿瘤中若存在以下主要条件之一，即较多核分裂 (＞5/50HPFs)、异常核分裂和静脉侵犯，应诊断为癌;(2)若存在以下次要条件之一，即较大的体积和/或重量 (＞10 cm和/或＞200 g)，有坏死、小血管或窦隙浸润，应归为不确定恶性潜能的肿瘤; (3)缺乏以上主要及次要条件提示为良性腺瘤。本组病例应用该标准进行良恶性判断。

EGFR的异常活化，可引起细胞的增殖、分化，血管的生成及细胞的转移［11］。有文献报道EGFR蛋白在肾上腺皮质癌中存在过表达［13-14，17］，但尚未见文献报道其在肾上腺嗜酸细胞型皮质肿瘤中的表达情况。本研究结果显示EGFR在嗜酸细胞型皮质癌中的表达率及表达强度明显高于腺瘤，这与EGFR在肾上腺皮质癌中表达高于腺瘤的情况较一致［14，18］。有研究报道EGFR阳性表达提示肾上腺皮质肿瘤具有恶性倾向，提示EGFR蛋白可能是区分良恶性肾上腺皮质肿瘤的一个有价值的标志物［17］。

靶向EGFR基因突变的酪氨酸激酶抑制剂 (如吉非替尼、厄罗替尼等)已经应用于非小细胞肺癌患者，并获得良好的疗效。Kotoula等［19］在35例肾上腺皮质癌中检测出4例肿瘤 (11.4%)存在EGFR基因突变，但是本研究及先前的研究均未检测出EGFR基因突变，其原因可能是Kotoula等应用直接测序的方法，可以检测出所有已知和未知的突变，而本研究所应用的检测方法仅能检测出29种已知常见的突变位点。

EGFR基因拷贝数的改变可见于多种恶性肿瘤，包括非小细胞肺癌、胶质母细胞瘤、胰腺癌及头颈部鳞癌，但在肾上腺皮质癌中的改变鲜有报道。本研究组曾对肾上腺皮质癌的 EGFR基因拷贝数进行研究［14］，本研究结果与其一致，嗜酸细胞型皮质癌及腺瘤均未见EGFR扩增，但EGFR高多体性更常见于肾上腺嗜酸细胞型皮质癌，而腺瘤中多表现为二体性及低三体性。希望今后能进一步积累病例，分析癌与腺瘤EGFR基因拷贝数的差异性改变，及其与临床病理的关系。

总之，肾上腺嗜酸细胞型皮质癌是一种罕见肿瘤，本研究结果显示EGFR蛋白过表达及7号染色体高多体性常见于嗜酸细胞型皮质癌，提示其可能作为区分良恶性肾上腺皮质肿瘤有价值的标志物。今后可通过积累病例进一步研究EGFR基因在肾上腺嗜酸细胞型皮质肿瘤中的状态，希望为将来该肿瘤的临床分子靶向治疗提供潜在方向。

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Clinicopathological Features and Epidermal Growth Factor Receptor Gene Status of Adrenocortical Oncocytic Carcinoma

ZHANG Jing，GAO Jie，WU Sha-fei，LU Tao，LIANG Zhi-yong

Department of Pathology，Peking Union Medical College Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences＆Peking Union Medical College，Beijing 100730，China

ObjectiveTo explore the clinicopathological features of adrenocortical oncocytic carcinoma and protein expression，gene mutation，and gene copy number alteration of epidermal growth factor receptor (EGFR)in this carcinoma．MethodsWe reviewed the clinical and histomorphological features of 9 adrenocortical oncocytic carcinoma cases who received surgical resection in the period of January 2000 to December 2009 in Peking Union Medical College Hospital，and 9 adenoma cases were included as control．EGFR protein expression，EGFR gene mutation and EGFR gene copy number alteration in both groups were detected by immunohistochemistry，Scorpion Amplification Refractory Mutation System(ARMS)，and fluorescence in situ hybridization (FISH)，respectively．ResultsThe 9 cases of adrenocortical oncocytic carcinomas included 2 cases of Cushing's syndrome and 7 cases of nonfunctional cortical carcinoma．All cases were followed up for 6 to 56 months，and 2 patients with adrenocortical oncocytic carcinomas lost to follow-up，and 6 died．In the adrenocorti-cal oncocytic carcinoma patients，EGFR overexpression was found in 77.8%(7/9)，and EGFR FISH was positive in 55.6%(5/9)．In contrast，only 22.2%(2/9)of the adrenocortical adenoma patients showed EGFR weak expression and none had positive FISH result．No EGFR gene amplification or mutation was found in the 2 groups of patients．ConclusionsAdrenocortical oncocytic carcinoma is rare．EGFR overexpression and chromosome 7 polysomy are frequent abnormality in the adrenocortical oncocytic carcinomas，which may be used in the differential diagnosis．Also，an investigation of the gene status of EGFR should facilitate the identification of a target therapeutic regimen for carcinoma patients．

adrenocortical oncocytic carcinoma;epidermal growth factor receptor;immunohistochemistry;fluorescence in situ hybridization;gene mutation

LIANG Zhi-yong Tel:010-69159369，E-mail:liangzhiyong1220@yahoo．com

R736.6;R365

A

1674-9081(2015)03-0191-06

10.3969/j.issn.1674-9081.2015.03.006

2015-02-27)

梁智勇 电话:010-69159369，E-mail:liangzhiyong1220@yahoo．com