韩 珑 王正林 刘 辉 余宏铸

脂多糖对正常人肝内胆管上皮细胞TLR4-NF-кB通路的影响

韩 珑 王正林 刘 辉 余宏铸

目的探讨脂多糖(LPS)对正常人肝内胆管上皮细胞(HiBECs)中TLR4-NF-кB通路的影响。方法HiBECs常规细胞培养后，加入不同浓度的LPS(0.1、1、4、8、10 μg/mL)，刺激不同时间(3、6、9、12、24 h)，用Realtime RT-PCR分析细胞内TLR4和NF-κB mRNA表达水平。结果LPS刺激HiBECs后TLR4和NF-κB mRNA表达水平均增加，HiBECs在受到LPS(4 μg/mL)刺激后TLR4和NF-κB mRNA表达水平随时间延长而增加，于6小时达高峰，之后下降。以相同时间(6 h)刺激HiBECs后，TLR4和NF-κB mRNA表达水平随LPS浓度增高而增加，LPS浓度为4 μg/mL时达高峰，之后下降。结论LPS可以激活HiBECs中的TLR4-NF-кB通路，并且有时效和量效依赖关系。

人正常肝内胆管上皮细胞；脂多糖；Toll样受体4；核转录因子-кB

肝内胆管可因结石梗阻导致局部胆汁淤积而反复发生细菌感染，造成胆道系统慢性炎症环境的持续存在，是肝内胆管上皮细胞癌变的主要诱因[1]。胆道系统感染多为革兰氏阴性菌，其外壁层中具有一种特有的化学成分脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)。目前，关于LPS激活经典炎症通路LPS-TLR4-NF-кB报道很多[2-4]，但研究多集中于肿瘤组织和人体其他正常组织细胞的体外培养，而LPS作用于正常人肝内胆管细胞(human intrahepatic biliary epithelial cells，HiBECs)，激活该通路，并使正常细胞瘤变的研究较少。本研究在体外细胞实验中检测LPS对HiBECs中TLR4-NF-кB通路的影响，以期了解受感染的细胞瘤变的可能机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 正常人肝内胆管细胞(HiBECs)为一代细胞，购自上海雷蒂生物科技发展有限公司；脂多糖(LPS)购自美国Sigma公司；RPMI 1640培养基购自美国Invitrogen公司；四季青胎牛血清购自浙江天杭生物技术有限公司；RT逆转录试剂盒购自Fermentas Life Sciences；RNAiso Reagent、Real-time PCR试剂盒购自大连宝生物工程有限公司；所有引物均采用primer 5.0软件设计，由上海生工生物工程公司合成(见表1)。RIPA裂解液购自南京凯基生物科技发展有限公司；鼠抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)单克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司，兔抗TLR4多克隆抗体、兔抗NF-κB多克隆抗体购自美国Biogot Biotechnology公司；羊抗小鼠二抗、羊抗兔二抗购自北京中山金桥生物有限公司；增强化学发光底物检测试剂盒(ECL发光剂)购自碧云天生物技术研究所。

表1 Realtime RT-PCR分析HiBECs中目的基因及内参的引物序列

1.2 人肝内胆管上皮细胞培养 RPMI 1640培养基中添加10%胎牛血清、105U/L青霉素、105U/L链霉素，为完全培养基，人肝内胆管上皮细胞(HiBECs)用完全培养基在37℃、5%CO2、95%湿度的条件下培养。当细胞生长密度达80%时，换成不含青霉素、链霉素，含10%胎牛血清的RMPI 1640培养基，将细胞分为正常对照组(NC组)、不同浓度的LPS组，LPS组加入不同浓度的LPS(0.1、1、4、8、10 μg/mL)分别刺激3、6、9、12、24 h，收集细胞进行RT-PCR检测。

1.3 TLR4和NF-κB mRNA表达的检测 提取各组HiBECs细胞总RNA，RT逆转录试剂盒逆转录成单链cDNA，Realtime RT-PCR分析TLR4和NF-κB mRNA表达水平，在美国ABI公司StepOnePlus仪上进行扩增，用比较Ct法(△△Ct)分析结果。

2 结果

2.1 LPS刺激HiBECs不同时间点TLR4-NF-κB的表达 与NC组相比，LPS(4 μg/mL)刺激HiBECs后TLR4、NF-κB mRNA表达水平均增加(P<0.05)，表明LPS激活HiBECs中TLR4-NF-κB通路，从而介导炎症反应。与NC组相比，TLR4、NF-κB mRNA表达量在LPS刺激6小时达高峰：TLR4 mRNA增加35.00倍(P=0.036)、NF-κB mRNA增加了6.55倍(P=0.030)，此后随刺激时间延长，表达量下降，LPS(9小时)组TLR4、NF-κB mRNA表达水平较LPS(6小时)组下降(P<0.05)，6 h为效应最强的刺激作用时间。TLR4 mRNA与NF-κB mRNA表达量之间存在正相关(r=0.979，P<0.05)。详见图1。

图1 LPS刺激HiBECs不同时间点TLR4、NF-κB mRNA的表达情况

NC与LPS组(4 μg/mL)：3、6、9、12、24小时与NC组相比：*P<0.05；各实验组与LPS(6小时)组相比，**P<0.05；TLR4 mRNA与NF-κB mRNA表达量之间存在正相关性(r=0.979，P<0.05)

2.2 不同浓度的LPS对HiBECs中TLR4-NF-κB通路的影响 与NC相比，在一定范围内(≤4 μg/mL)，随着LPS浓度的增加，HiBECs中TLR4、NF-κB mRNA的表达水平均逐渐增加，但高浓度(≥8 μg/mL)LPS的刺激效应逐渐降低，TLR4、NF-κB mRNA的表达水平均减少，LPS(8 μg/mL)组TLR4、NF-κB mRNA表达水平较LPS(4 μg/mL)组下降(P<0.05)，4 μg/mL为效应最强的刺激浓度。TLR4 mRNA与NF-κB mRNA表达量之间存在正相关(r=0.975，P<0.05)。详见图2。

2.3 LPS对HiBECs中TLR4-NF-κB蛋白表达影响 使用效应最强的刺激浓度及刺激持续时间，即4 μg/mL LPS 刺激HiBECs 6 h后，从蛋白水平检测TLR4、NF-κB蛋白表达水平，与NC相比，LPS组TLR4、NF-κB蛋白表达增加(P<0.05)。详见图3。

图2 不同浓度的LPS对HiBECs中TLR4、NF-κB mRNA表达的影响

NC与LPS组(6小时)：0.1、1、4、8、10 μg/mL与NC组相比：*P<0.05；各实验组与LPS(4 μg/mL)组相比，**P<0.05；TLR4 mRNA与NF-κB mRNA表达量之间存在正相关性(r=0.975，P<0.05)

图3 4 μg/mL LPS刺激HiBECs 6 h对TLR4、NF-κB蛋白表达的影响

NC与LPS组(4 μg/mL，6小时)相比：*P<0.05

3 讨论

炎症参与机体对外界感染的防御机制，然而，反复慢性炎症刺激却与癌症的发生发展密切相关[5-7]。有研究[8]表明，约15%～20%肿瘤的发生发展与感染引起的炎症有关。全球每年大约有120万例肿瘤病例可归结于慢性感染[9]，如幽门螺杆菌感染引起胃癌，念珠菌感染与口腔癌，EB病毒感染与鼻咽癌，乙型肝炎病毒感染与肝细胞癌等。在我国，肝内胆管结石与肝内胆管癌的发病密切相关[10]。有文献[11]报道在肝内胆管结石基础上肝内胆管细胞癌的发生率为11.7%～12.5%。胆道感染的细菌主要为革兰氏阴性菌[12]，其细菌外壁层中具有的LPS是介导炎症通路TLR4-NF-κB产生应答的主要配体。现已有较多研究证实，TLR4-NF-κB通路的异常激活与肿瘤的发生发展有密切的联系[13]，而且有相关研究表明NF-κB在肝内胆管结石合并肝内胆管细胞癌组织呈过表达[14,15]。但多集中于LPS作用于人体肿瘤细胞和人体其他正常组织细胞的研究，而LPS对正常人肝内胆管细胞(HiBECs)作用的报道却很少。

TLR4是Toll样受体家族(Toll like receptor，TLR)成员之一。TLR是一类天然免疫受体，几乎分布于所有的细胞系。人类胆管上皮细胞主要表达TLR1-10[16]，其中TLR4是介导LPS应答的最主要受体[17]。本研究发现LPS在一定浓度范围及作用时间范围内刺激HiBECs，使TLR4 mRNA表达量增加，提示炎症刺激物LPS与TLR4受体结合后，将炎症信号转导到细胞内，促使细胞合成更多的TLR4受体。

LPS与TLR4结合后主要通过两条不同途径激活NF-κB：一条是髓样分化因子88(MyD88)依赖的信号通路；另一条为MyD88非依赖的信号通路。NF-κB作为“炎癌链”的关键环节，调控众多基因的转录，影响机体免疫、炎性反应、细胞凋亡与增殖等多种活动。另外，在多种肿瘤细胞的增殖侵袭调控中也发挥中枢性作用[5,6]。HiBECs在低浓度LPS及短时间刺激时，NF-κB mRNA的表达量并不高。本实验发现当LPS浓度增加到4 μg/mL，持续作用时间延长至6 h时，NF-κB mRNA的表达量最高。此时，LPS一方面使NF-κB mRNA表达增加，使蛋白质合成增加，另一方面，LPS通过信号传递，激活NF-κB依赖性蛋白激酶NIK和IκB蛋白激酶，最终使IκB降解，从而激活NF-κB，使之产生核转信号[18]。LPS刺激的强弱，刺激持续的时间与机体细胞对炎症刺激的反应，决定了正常肝内胆管细胞是走向修复或是炎症死亡，甚至恶性转化，这对研究发病机制有重要意义。

本实验中，加入不同刺激时间(3、6、9、12、24 h)和不同浓度(0.1、1、4、8、10 μg/mL)的LPS，TLR4和NF-кB mRNA表达水平在一定范围内均增加，随后下降。提示LPS可以激活HiBECs中的TLR4-NF-κB炎症通路，且LPS对HiBECs内TLR4-NF-кB通路的激活具有时效及量效依赖关系。这种时效与量效反应关系也体现在其他组织中，如巨噬细胞和人牙周膜细胞[19,20]。

本研究还发现，NF-κB mRNA的表达量变化与TLR4几乎一致，TLR4 mRNA与NF-κB mRNA表达量之间存在正相关，这与人体牙周膜细胞的体外实验结果相同[16]，也与Obando-Pereda等[21]的结果相同。说明细胞外刺激信号LPS通过TLR4-NF-κB激活了细胞内的炎症通路，NF-κB从细胞质转移到细胞核，启动靶基因的转录，包括IκB、黏附分子、COX-2以及各种细胞因子和趋化因子等[13,22]，这些因子能够形成一个特殊的微环境。如果这个微环境发生在正常组织周围，将直接诱导细胞中抑癌基因或癌基因的突变, 使正常细胞向恶性转化。

本研究同时观察到LPS作用6 h，TLR4和NF-кB mRNA表达水平达高峰，此后随着LPS刺激时间延长，TLR4、NF-кB mRNA表达水平逐渐下降，至24小时逐渐稳定于一较高水平，提示LPS激活了LPS-TLR4-NF-кB通路的同时，可能也激活了细胞清除LPS，抑制细胞内炎症通路表达的机制，这体现了HiBECs具有自身的内毒素耐受性，与Harada[23]等的研究结果相同。这种性质体现了胆道系统先天的免疫性，并且维持胆道系统局部环境的稳态。

总之，LPS可以激活HiBECs中TLR4-NF-κB通路，使细胞表达各种炎症因子，介导细胞炎症损伤。不同的损伤程度及细胞恢复程度将导致细胞不同的转归，可能是肝内胆管结石引起局部长期慢性炎症，最终导致正常肝内胆管细胞癌变的发病机制。此外HiBECs特有的内毒素耐受性质为其提供了一道抵御细胞慢性炎症的屏障，维持胆道局部环境的稳态，而这种胆道系统自身免疫性质的破坏与失衡也可能为探讨胆道感染、胆道炎症和胆道肿瘤等疾病的发生与发展提供新的线索，有待进一步深入研究。

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(2015-01-20收稿 2015-03-19修回)

Effect of LPS on TLR4-NF-кB pathway in human intrahepatic biliary epithelial cells

HanLong,WangZhenglin,LiuHui,etal

DepartmentofGeneralSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230022,China

Objective To investigate the effect of lipopolysaccharides (LPS) on TLR4-NF-кB pathway in human intrahepatic biliary epithelial cells (HiBECs) in vitro.Methods HiBECs were cultured and divided into normal control group (NC) and LPS group. LPS group was treated with LPS at different time (3 h, 6 h, 9 h, 12 h, 24 h)and different concentrations (0.1, 1, 4, 8, 10 μg/mL). The expression of TLR4 and NF-кB was assessed by realtime-PCR and Western blot.Results LPS upregulated the expression of TLR4 and NF-кB in HiBECs. The TLR4 and NF-κB mRNA transcription was increased at different time of LPS stimulation, and reached its peak on 6 h and then gradually decreased. Simultaneously, the TLR4 and NF-κB mRNA expression level was increased in a dose-dependent manner,and reached its peak when used at 4 μg/mL LPS and then decreased.Conclusion LPS activates TLR4-NF-кB signaling in HiBECs in a time-and dose-dependent manner.

Human intrahepatic biliary epithelial cells；Lipopolysaccharides；Toll-like receptor 4；Nuclear factor-κB

安徽省年度重点科研项目(1301043034)

230022 合肥 安徽医科大学第一附属医院普外科

余宏铸，hongzhu.620929@aliyun.com

10.3969/j.issn.1000-0399.2015.07.034