李 博 毛颖民 杨建生 赵仲生

MMP-11在胃癌组织的表达及临床意义

李 博 毛颖民 杨建生 赵仲生

目的 观察MMP-11蛋白在胃癌组织的表达。方法 采用免疫组织化学技术检测436份胃癌组织及92份邻近正常胃黏膜组织石蜡标本MMP-11表达情况。结果 MMP-11在正常胃黏膜组织的表达低于胃癌组织（0 vs 47.5%，χ2＝73.424，P＜0.01）。MMP-11表达与胃癌患者肿瘤大小、分化、侵犯深度、分期、淋巴转移、远处转移、脉管侵犯、Lauren分型相关（P＜0.05），而与组织类型、性别无关。肿瘤≥5cm者MMP-11阳性表达率62.8%，明显高于肿瘤＜5cm者的36.7%（χ2＝28.781，P＜0.001）；弥漫型者MMP-11阳性表达率明显高于肠型者（85.9%比10.7%，χ2＝246.751，P＜0.001）；T3、T4期者MMP-11阳性表达率分别为58.6%、96.2%，明显高于T1、T2期的10.5%、30.3%（χ2＝80.969，P＜0.001）；Ⅲ期、Ⅳ期胃癌患者MMP-11阳性表达率分别为68.8%、95.7%，高于Ⅰ期、Ⅱ期患者的7.8%、14.4%（χ2＝198.170，P＜0.001）；脉管侵犯者MMP-11阳性表达率明显高于无脉管侵犯者（70.0%比16.4%，χ2＝122.193，P＜0.001）；淋巴结转移胃癌患者的MMP-11阳性表达率为68.9%，高于无淋巴结转移的12.7%（χ2＝130.382，P＜0.001）；有远处转移者的MMP-11阳性表达率95.1%，高于无远处转移者的39.7%（χ2＝64.455，P＜0.001）。根据多因素Logistic回归分析，MMP11的表达在TNM分期高、脉管侵犯、有远处转移的患者中发生率高。结论 MMP-11或参与了胃癌的浸润转移进程，检测MMP-11的表达可作为判断胃癌生物学行为的重要参考指标。

胃肿瘤；浸润转移；基质金属蛋白酶-11

图1 MMP-11在正常胃黏膜组织中的阴性表达（SP法× 400）

图2 MMP-11在胃低分化腺癌中的强阳性表达（SP法× 400）

图3 MMP-11在胃低分化腺癌中的强阳性表达（SP法× 100）

图4 MMP-11在胃中分化腺癌中的强阳性表达（SP法× 400）

基质金属蛋白酶（MMPs）是锌依赖性内肽酶家族，参与肿瘤的血管、淋巴管生成、肿瘤浸润生长、远处转移多个过程[1-2]，是整个恶性肿瘤自然生长过程中癌细胞主动配体，在肿瘤的发展起着重要作用[3]，与肿瘤发生、浸润和转移相关。我们采用免疫组化的方法分析MMP-11蛋白在胃癌组织的表达，为临床肿瘤的诊治寻找新的参考指标。

1 材料与方法

1.1 标本来源 选择1998年1月—2004年12月在浙江省人民医院接受手术治疗、资料完整的胃癌患者436例436份胃癌组织为实验样本，均经病理证实，术前未经任何治疗。HE切片后由有经验的医生核实临床病理诊断，选取样点做成组织芯片。取同期距癌边缘5cm以上的临近无增生或不典型增生的非肿瘤胃黏膜标本92份为对照。

1.2 试剂和仪器

1.2.1 免疫组化实验仪器 组织芯片制备系统HT－1型（辽宁朝阳恒泰科技发展有限公司），Olympus CH3D光学显微镜（日本Olympus Optical CD公司）。

1.2.2 免疫组化实验试剂 鼠抗人MMP-11抗体（美国ADCAM公司），山羊血清工作液和广谱二抗试剂盒、DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.3 免疫组化方法

1.3.1 切片制作 切片后过夜；二甲苯15min浸2次；100%酒精浸3次、95%酒精浸2次、80%酒精浸1次、75%酒精浸1次，1次浸5min；蒸馏水冲洗5min 1次；0.01M、pH7.4 PBS洗5min×2次。

1.3.2 免疫组织化学SP法染色 枸橼酸盐缓冲液（0.01M、pH6.0）高压修复3min，自然冷却后，PBS冲洗5min×3次；3%H2O2中室温下避光孵育15min，PBS冲洗5min×3次；山羊血清工作液室温下孵育10min；倾去血清，直接滴加一抗工作液（MMP-11稀释比1:50），4℃过夜。PBS冲洗3min×3次；滴加广谱二抗试剂，室温孵育30min。PBS冲洗3min×3次；DAB光镜下控制显色、自来水充分冲洗；苏木素复染，盐酸酒精分化；切片脱水、透明、封片：将上述切片依次经85%酒精2～5min；95%酒精2～5min；100%酒精5min×2次；二甲苯10min×2次；中性树胶封片，光镜下观察结果。

1.3.3 免疫组化染色结果判定 以细胞质出现棕黄色颗粒为阳性，根据染色程度和染色细胞百分率进行评定和分析：基本不着色者为0分，着色淡者为1分，着色适中者为2分，着色深者为3分；着色细胞占计数细胞的百分率≤5%记0分，6%～25%记1分，26%～50%记2分；≥51%记3分。将每张切片的染色程度与染色细胞百分率得分相乘，其乘积为最后得分。0～1分为阴性（-），2～3分为弱阳性（+），4～6分为中等阳性（++），＞6分为强阳性（+++）。在统计分析中，将表达（－/＋）划为阴性表达，（＋＋～＋＋＋）划为阳性表达。

1.4 统计学方法 应用SPSS16.0软件进行数据分析，各组间的MMP-11阳性表达率比较采用卡方检验，P＜0.05为差异有统计学意义。根据单因素统计结果，选择相关多个因素采用多因素Logistic分析。

2 结果

2.1 正常胃黏膜组织和胃癌组织MMP-11的表达

在92份非肿瘤胃黏膜组织中，MMP-11蛋白均为阴性表达，无强阳性表达，见图1（封二）。436份胃癌组织中，强阳性表达129份（29.6%），中等阳性表达78份（17.9%），MMP-11蛋白在胃癌组织中的阳性表达率为47.5%，与正常胃黏膜组织比较，差异有统计学意义（0 vs 47.5%，χ2＝73.424，P＜0.01）。胃癌表达MMP-11阳性颗粒主要位于肿瘤细胞的细胞质和（或）间质组织中，呈非均质性，见图2～4（封二）。

2.2 MMP-11蛋白表达与胃癌病理学指标间的关系

肿瘤≥5cm者的MMP-11阳性表达率62.8%，明显高于＜5cm者的36.7%（P＜0.001）；弥漫型胃癌MMP-11阳性表达率明显高于肠型（P＜0.001）；T3、T4期MMP-11阳性表达率明显高于T1、T2期（P＜0.001）；Ⅲ期、Ⅳ期胃癌MMP-11阳性表达率明显高于Ⅰ期、Ⅱ期MMP-11（P＜0.001）；脉管侵犯者MMP-11阳性表达率高于无脉管侵犯者（P＜0.001）；淋巴结转移者MMP-11阳性表达率明显高于无淋巴结转移者（P＜0.001）；有远处转移者MMP-11阳性表达率明显高于无远处转移者（P＜0.001）。MMP-11蛋白表达与胃癌病理学指标间的关系见表1。

选择MMP-11阳性表达的指标、肿瘤大小、Lau－ren分型、分化程度、淋巴结转移、脉管侵犯、远处转移、TNM分期，根据多因素Logistic回归分析，MMP11的表达在TNM分期高、脉管侵犯、远处转移的患者中发生率较高，见表2。

表1 MMP-11在胃癌组织的表达及与胃癌病理指标间的关系

表2 logistic回归分析MMP-11与胃癌病理指标间的相关因素

3 讨论

浸润和转移是恶性肿瘤最重要的生物学特征之一，肿瘤细胞要发生局部浸润和远处转移，首先必须突破细胞外基质的屏障。MMPs则是降解细胞外基质的主要酶类,能降解几乎所有的细胞外基质成分。MMP-11属于MMPs家族，并具有一些独特的特性，①MMP-11能降解非细胞外基质的丝氨酸蛋白酶抑制剂、α1抗胰蛋白酶、胰岛素样生长因子结合蛋白-1[4-5]；②MMP-11在细胞内以45kDa的酶形式为活化状态释放[1]。而大多数MMPs以无活性的酶原形式分泌到细胞外，在细胞外才被激活[1]。临床发现，MMP-11在大多数恶性肿瘤如乳腺癌、胰腺癌、口腔癌和食管癌组织有表达。Delebecq[6]研究129例非小细胞肺癌，对比分析u-PA、MMP-2、MMP-11组织蛋白酶类B、L的表达和肿瘤的病理学分型、肿瘤大小、肿瘤转移及淋巴转移等之间的关系，认为MMP-11与非小细胞肺癌的淋巴结转移有相关，可以作为临床判断的一个指标。

Masson[7]研究发现，MMP-11缺失小鼠中恶性肿瘤的发生、发展过程明显发生改变。MMP-11缺失抑制7，12-二甲基苯并蒽诱导肿瘤发生的能力，MMP-11缺失小鼠的成纤维细胞也失去促进MCF7肿瘤细胞株局部种植的能力。MMP-11的作用机制可能与细胞凋亡有关[8]，与SP1位点，及ERK1/2-有丝分裂原活化激酶（mitogen activated proteinkinase，MAPK）信号通路有关。Takeuchi[9]发现MMP-11能够抑制癌细胞的凋亡,从而促进肿瘤生长。Boulay[10]研究发现MMP-11酶缺失鼠中，肿瘤细胞的凋亡和坏死情况明显高于野生型鼠。说明MMP-11降低了肿瘤细胞凋亡及坏死而影响肿瘤的进展。有研究[11]发现，MMP-11通过改变基质环境而创造有利于肿瘤细胞生存的环境，影响肿瘤的进展。MMP-11缺陷小鼠肿瘤细胞脂肪浸润及凋亡有明显提高[12]。

我们通过免疫组化研究发现胃癌组织MMP-11蛋白的表达水平与肿瘤大小、lauren分型、浸润深度、脉管侵犯、淋巴结转移、远处转移及肿瘤分期相关（P＜0.05）， MMP-11高表达组肿瘤浸润较深，较易侵犯脉管，而且也较易发生淋巴结转移及远处转移，与低表达组相比，差异有统计学意义。MMP-11高表达组多为Ⅲ、Ⅳ期，MMP-11低表达组则多处于Ⅰ、Ⅱ期，随着分期进展，MMP-11表达升高。多因素Logistic回归分析，MMP11表达在TNM分期高、脉管侵犯、远处转移的患者中发生率高，也就是在肿瘤发生局部侵犯、局部脉管侵犯、远处种植转移等肿瘤生长、侵袭活动剧烈时，MMP-11的表达明显升高，提示MMP-11的高发达可能，促进肿瘤的生长、侵袭。

综上所述，MMP-11在肿瘤的发病及恶化进展过程中发挥一定的作用[13]，可能是一个重要的肿瘤发展因素，对胃癌的预后判断有一定的参考价值。

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［13］李博.MMP-11和IGF-1在胃癌组织中的表达及其与浸润转移关系的研究［D］.浙江大学硕士论文，2009.

（收稿：2014-10-16 修回：2015-01-28）

Expression of MMP-11 in Gastric Cancer Tissues and Its Clinical Significance

LI Bo1,MAO Yingmin1,YANG Jiansheng1,ZHAO Zhongsheng2.1 Interventional Medicine Ward；2Department of Pathology,Zhejiang Provincial People's Hospital,Hangzhou(310014),China

Objective To investigate the expression of MMP-11 in gastric cancer.M ethods MMP-11 expression in sample tissues from 436 cases with gastric cancer and 92 cases of cancer adjacent gastric mucosa was detected immunohisochemically.Results MMP-11 expression in cancer adjacent gastric mucosa was significantly lower than that in gastric cancer tissues（0 vs 47.5% χ2＝73.424,P＜0.01）.MMP-11 expression was related to tumor size,differentiation,depth of invasion,stage,lymph node metastasis,distant metastasis,vascular invasion,and Lauren classification of gastric cancer（P＜0.05）,but was not associated with histologic type and gender of patients（P＞0.05）.MMP-11 positive rate in gastric cancer patients with tumor size≥5cm was significantly higher than that in patients with tumor size＜5cm（62.8%vs 36.7%;χ2＝28.781,P＜0.001）;that in patients with diffusing type cancer increased to 85.0%as compared with 10.7%in patients with intestinal-type cancer（χ2＝246.751,P＜0.001）;that in patients at stage T3 and T4 was 58.6%and 96.2%,respectively,which were higher than that in patients at stage T1 and T2（10.5%and 30.3%,χ2＝80.969,P＜0.001）;that in patients with stageⅢ,Ⅳ cancer（68.8%,95.7%）were significantly higher than that in patient with stageⅠ,Ⅱ cancer（7.8%,14.4%;χ2＝198.170,P＜0.001）;that in patients with vascular invasion was 70.0%as compared with 16.4%of patients without vascular invasion MMP-11（χ2＝122.193,P＜0.001）;that in patients with lymph node metastasis was higher than that in patients without lymph node metastasis（68.9%vs 12.7%;χ2＝130.382,P＜0.001）;that in patients with distant metastasis increased to 95.1% as compared with 39.7%in patients without distant metastasis（χ2＝64.455,P＜0.001）.Multi-factor logistic regression analysis showed that MMP-11 high expression was seen in patients with high TNM staging,vascular invasion,ordistant metastasis.Conclusion MMP-11 may involve in process of invasion and metastasis of gastric cancer. MMP-11 could be used as an important reference indicator for evaluation of biological behavior of gastric cancer.

gastric neoplasma;neoplasma invasion;matrix metalloproteinases-11

浙江省医药卫生科技计划项目（No.2014KYA013）

浙江省人民医院介入病房（李博、毛颖民、杨建生）、病理科（赵仲生）（杭州 310014）

李博，Tel：13989856315；E-mail：13989856315@163.com