葛熙 ，洪煜婧，赵枰

(1、南通大学第二附属医院检验科，江苏 南通226001；2、南通大学公共卫生学院预防医学141班，江苏 南通226019)

慢性粒细胞白血病(Chronic myeloid leukemia，CML)是一起源于造血干细胞的血液系统恶性疾病。临床上分为慢性期、加速期和急变期，临床上急性变是引起患者死亡的主要原因。寻找CML急性变的相关基因对于揭示CML发生急性变的分子机制及探索治疗的新靶点具有重要的意义。有研究表明，BMI-1(B-cell-specific Moloney murine leukemia virus integration site1)基因表达增高的病例更易转变为急性白血病[1]。本文用免疫组化方法，检测BMI1基因表达产物BMI-1蛋白在CML各期中的表达，初步探讨BMI-1蛋白在CML中的表达及意义。

1 材料与方法

1.1 一般资料 CML诊断及疗效判定参照张之南主编 《血液病诊断及疗效标准》[2]。选择2010年1月至2014年12月在南通大学第二附属医院血液科就诊的门诊和住院的CML患者41例，男29例，女12例，年龄42～79岁。其中慢性期(CML-CP)26例，加速期(CML-AP)6例，急变期(CM-BP)9例。加速期和急变期15例化疗后完全缓解11例 (缓解组)，未缓解4例(未缓解组)。对照组10例来自本院健康志愿者，男7例，女3例，年龄48～70岁。

1.2 检测方法 用免疫组织化学法检测CML患者骨髓单个核细胞BMI-1蛋白，BMI-1多克隆抗体为美国Santa Crus公司的产品，生物素标记的羊抗小鼠二抗及SP免疫标记试剂盒为北京中杉金桥生物技术有限公司的产品。抽取骨髓液2ml，用EDTA抗凝，加入等量的人淋巴细胞分离液，以2 000r／min离心15min，分离出单个核细胞并涂片，干燥，室温下用新鲜配制的丙酮溶液固定30 min，经磷酸盐缓冲液(PBS 0.01mol/L，pH7.4)漂洗3次；0.1%Triton 100通透10min，再用PBS漂洗3次，后根据试剂说明书进行实验操作。每一批实验同时做阳性及空白对照，阳性对照采用胃癌切片(由益源试剂公司提供)，以PBS代替一抗做空白对照检测。

1.3 结果判定 细胞胞浆或细胞核上着棕黄色颗粒状弥漫或局灶分布者为阳性细胞。参照全国免疫组化技术诊断标准化专题研讨会意见，根据阳性所占的比例及显色程度对阳性细胞进行积分：

(1)细胞质和(或)核内见浅黄色颗粒，明显高于背景底色，阳性颗粒所占细胞面积的比例<50%计1分；(2)细胞质和(或)核内见较深黄色颗粒，阳性颗粒占细胞面积的比例约在51%~70% 计2分；(3)细胞质和(或)核内见大量深黄色颗粒，浆和(或)核可被颗粒掩盖而不显，阳性颗粒所占细胞面积的比例>70%计3分。每片计500个细胞中的阳性细胞数，计算表达率及阳性积分。

1.4 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件进行统计学处理，计量资料用均值±标准差(x±s)表示，多组间检验采用方差分析，组间两两比较采用q检验；两组间均数比较采用独立样本t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 BMI-1蛋白在各期CML患者骨髓单个核细胞中的表达 BMI-1蛋白阳性产物呈棕黄色颗粒状大多数定于细胞浆内，见图 1，CML-AP/BP组BMI-1蛋白表达阳性率及阳性积分均显著高于对照组和CML-CP组(P<0.05)，CML-CP组和对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

图1 CML细胞 BMI-1蛋白表达(S-P法染色，×1000)

表1 BMI-1蛋白在各组中表达的比较

2.2 BMI-1蛋白在CML-AP/BP患者治疗后骨髓单个核细胞表达的比较 BMI-1蛋白阳性产物呈棕黄色细颗粒状大多数弥散于细胞胞浆内，未缓解组BMI-1的表达显著高于缓解组(P<0.05)。见表2。

表2 BMI-1蛋白在治疗一疗程缓解组及未缓解组表达的比较(±s)

表2 BMI-1蛋白在治疗一疗程缓解组及未缓解组表达的比较(±s)

注：与未缓解组比较，*t=3.562,P=0.0003；△t=5.431,P=0.0000。

组别 例数 阳性率(%) 积分(分)未缓解组缓解组5 11 40.78±12.58 12.98±10.11*68.24±7.22 17.63±6.29△

3 讨论

1991年荷兰癌症中心在研究小鼠淋巴瘤时发现了BMI1基因，后被认为是癌基因C-myc的协同基因，属于多梳基因PcG(Polycomb group，PcG)家族；人类BMI1基因定位于10号染色体的短臂1区3带(10p13)，该区与恶性淋巴瘤和儿童白血病的染色体移位有关，BMI1基因与干细胞成长调控，细胞分化及恶变密切相关[3-7]。此外，BMI1基因在细胞周期的调节、细胞的永生化和衰老方面也有着重要作用[8，9]。 其有类似于癌基因的作用[10，11]。 动物试验表明[12]，表达BMI1的小鼠外周血中白血病细胞的数量明显多于BMI1缺失的小鼠，将BMI1缺失小鼠的骨髓细胞移植给受者小鼠，这些小鼠不发生急性髓系白血病，但将BMI1转染原本BMI1缺失的小鼠骨髓细胞中，然后移植给受者小鼠，受者小鼠则可发生急性髓系白血病，说明Bmi1对白血病干细胞的增殖以及致白血病的能力具有决定性作用。研究还发现[13]，急性白血病病人的骨髓中BMI1的表达水平明显高于正常人，尤其是在急性髓细胞白血病微分化型的病人骨髓中，BMI1的表达水平更高。

本研究通过免疫组织化学法检测CML患者骨髓单个核细胞中BMI1基因的表达，发现CMLAP/BP组BMI-1蛋白阳性率及积分远高于对照组和 CML-CP组(P<0.05)，CML-CP组则和对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，提示BMI1基因可能在CML急变过程中发挥了一定的作用，其分子机制尚需进一步阐明。本研究发现标准方案化疗一疗程未缓解组BMI-1蛋白阳性率及积分显著高于一疗程缓解组(P<0.05)，提示BMI1基因高表达与CML细胞对化疗药物的敏感性有关，其分子机制尚需进一步阐明。结果还提示BMI1基因高表达参与了CML的急性变，干预BMI1基因的表达可能为CML靶向治疗提供新的思路。检测CML患者骨髓单个核细胞中BMI1基因的表达水平可作为预后评价的一个参考指标，对临床治疗具有一定的指导意义。

[1]Mihara K,Chowdhury M,Nakaju N,et al.Bmi-1 is useful as a novel molecular marker for predicting progression of myelodysplastic syndrome and patient prognosis[J].Blood,2006,107(1):305-308.

[2]张之南,沈悌.血液病诊断及疗效标准[M].第3版.北京:科学出版社,2007:134-136.

[3]Sauvageau M,Sauvageau G.Polycomb group genes:keeping stem cell activity in balance[J].PLoSBiol,2008,6(4):e113.

[4]Takihara Y.Role of Polycomb-group genes in sustaining activities of normal and malignant stem cells[J].Int JHematol,2008,87(1):25-34.

[5]Lobo NA,Shimono Y,Qian D,et al.The biology of cancer stem cells[J].Annu Rev Cell Dev Biol,2007,23:675-699.

[6]Valk-Lingbeek ME,Bruggeman SW,Lohuizen M.Stem cells and cancer;the polycomb connection[J].Cell,2004,118(4):409-418.

[7]Park IK,Morrison SJ,Clarke MF.Bmi1,stem cells,and senescence regulation[J].JClin Invest,2004,113(2):175-179.

[8]Jiang Y,Su B,Meng X,et al.Effect of siRNA-mediated silencing of Bmi-1 gene expression on HeLa cells[J].Cancer Sci,2010,101(2):379-386.

[9]Silva J,Garcia JM,Pena C,et al.Implication of polycomb members Bmi-1,Mel-18,and Hpc-2 in the regulation of p16INK4a,p14ARF,h-TERT,and c-Myc expression in primary breast carcinomas[J].Clin Cancer Res,2006,12(23):6929-6936.

[10]Honig A,Weidler C,Hlttuder S,et al.Overexpression．of polyeomb protein BMI1 in human specimens of breast，ovarian，endometrial and cervical cancer[J].Anticancer Res,2010,30(5):1559-1564．

[11]吴敏华,容伯芬,陈妙婵.慢性粒细胞白血病骨髓染色体核型异常的结果分析[J].实验与检验医学,2011,29(1):87.

[12]Lessard J,Sauvageau G.BMI-1 determines the proliferative capacity of normal and leukaemic stem cells[J].Nature,2003,423(6937):255-260.

[13]Sawa M,Yamamoto K,Yokozawa T,et al.BMI-1 is highly expressed in M0-subtype acute myeloid leukemia[J].Int J Hematol,2005,82(1):42-47.