许爱霞，薛冰，余跃华，吉丽

(江西省妇幼保健院检验科，江西 南昌330006)

卵巢早衰(Premature ovarian failure,POF)是指女性40岁前发生的卵巢功能衰竭，临床表现为绝经,且伴有雌激素水平下降和促性腺激素水平上升的疾病。POF不但给妇女造成心理创伤，而且患者的低雌激素水平增加了患骨质疏松症和冠心病的危险[1,2]。POF的病因十分复杂，涉及到遗传、免疫、病毒感染、医源性及心理等因素，约30%的POF是由遗传因素引起[3]，而约半数以上的POF患者找不到病因，称为特发性POF，其中50%~60%可能与免疫因素有关[4,5]。近几年卵泡发育相关基因在POF发病中的作用已有初步研究[6]。本实验拟探讨原癌基因c-erbB2和EGFR在卵巢早衰大鼠卵巢中的表达,为更深入了解卵巢早衰病因以及临床治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 Sprague-Dawley(SD)雌性大白鼠,10周龄,健康,体重200～220g,由南昌大学医学院动科部提供,合格证号为0319602。

1.1.2 主要试剂和仪器 c-erbB2多克隆抗体(北京博奥森公司)、EGFR多克隆抗体 (武汉博士德生物工程有限公司)；生物素标记的二抗 (北京中杉公司)；雷公藤多甙片(湖南协力药业有限公司生产,国药准字Z43020138)；人促卵泡生成激素放射免疫分析试剂盒、雌二醇放射免疫分析试剂盒、人促黄体生成激素放射免疫分析试剂盒(北京北方生物技术研究所)；放射免疫检测仪 (西门子 CENTAUR 5802)。

1.2方法

1.2.1 动物分组 大白鼠购入后适应性饲养1周，隔日换垫料,室温控制在25℃,湿度70%,通风良好。其后连续10d进行阴道涂片，以观察大鼠的动情周期，将有动情周期的20只大鼠纳入实验，并随机分为对照组和实验组，每组10只。实验组:口服灌胃法，生理盐水配制的雷公藤多甙片悬浮液按照50mg/Kg·d，共14d,造POF模型。 空白组:同剂量生理盐水灌胃，1次/d，共14d；自灌药第4d起，每日进行阴道涂片，观察动情周期，每两天测1次体重。

1.2.2 标本处理 给药结束后24h,对照组和模型组大鼠给予10%水合氯醛麻醉后眶周取血标本，处死，留取卵巢。留取的血标本静置后,离心,取上清液保存于低温冰箱，待激素检测。留取的卵巢置于中性福尔马林液中固定,石蜡包埋,连续切片,贴附于预先用多聚赖氨酸处理好的载玻片上，37~42℃烤片过夜，以备HE染色和免疫组化用。

1.2.3 黄体生成激素、雌二醇和促卵泡生成激素均采用放射免疫法检测，操作步骤和结果判断严格按说明书进行。

1.2.4 免疫组化染色 切片脱蜡，0.3%H202处理，抗原热修复后滴加封闭液，封闭后与EGFR或cerbB2多克隆抗体(1:200)孵育，4℃过夜，次日与生物素偶联的二抗工作液，37℃孵育20 min，再与辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液，37℃孵育20 min，DAB显色，苏木素复染。同时设置PBS缓冲液代替一抗的空白对照。

1.2.5 卵泡发育观察和组织学判断标准 每个蜡块取切片2张,每张切片观察5个视野,每组共观察计数40个高倍镜视野下卵巢最大横切面上的各级正常卵泡总数，最后取均数。组织学标准：初级卵泡为卵母细胞由单层立方状颗粒细胞包围；次级卵泡为卵母细胞由2层或2层以上的立方状颗粒细胞包围；成熟卵泡为卵泡发育的最后阶段,出现大的卵泡腔。闭锁卵泡为卵母细胞核固缩，染色体、胞质溶解，颗粒细胞层减少。

1.3 统计学分析 实验数据统计采用SPSSl3.0版本软件进行统计分析，计数资料以均数±标准差(x±s)表示，均数间的比较用t检验，以P<0.05具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组性激素水平检测结果 见表1。

表1 两组大鼠血清性激素水平比较(±s)

表1 两组大鼠血清性激素水平比较(±s)

注:与空白组比较*P<0.01。

组别 例数 FSH(mIU/ml)LH(mIU/ml)123.586±41.239 64.972±32.684*E2(pg/ml)空白组实验组10 10 1.639±0.715 1.639±0.715*2.586±0.893 4.524±1.871*

2.2 两组卵巢组织形态学观察 空白组卵巢卵泡生长活跃,可见较多的成熟和次级卵泡,较少闭锁卵泡，颗粒细胞层次多；实验组卵巢次级卵泡和成熟卵泡明显减少(P<0.01)，可见较多闭锁卵泡(P<0.01)，卵泡的颗粒细胞层次明显减少。见图1,表2。

表2 两组大鼠各级卵泡的构成(40个高倍视野)

图1培养前后的新生太鼠卵巢组织切片HE染色结果(×400)

2.3 ErbB2蛋白和EGFR蛋白在卵泡中的表达定位 用免疫组化SP方法检测不同组别的卵巢内ErbB2蛋白和EGFR蛋白的表达，结果显示，空白组ErbB2蛋白和EGFR蛋白阳性信号明显，主要位于卵母细胞胞膜上，为深棕色染色颗粒，实验组则阳性表达极少。见图2。

图2 ErbB2蛋白和EGFR蛋白在卵泡中的表达(SP×400)

3 讨论

POF近年来发病率不断升高，研究显示其在40、30、20岁以前的妇女中发病率分别为1%~2%、0.1%、0.01%[7,8],且有进一步年轻化的趋势。POF易导致生育力丧失及雌激素水平低下，由于病因未明，治疗效果不佳，严重影响患者的生活质量和身心健康。研究表明，POF发病的主要机制很可能是卵泡发育及成熟障碍[9]。由于卵巢卵泡发育需众多基因和信号通路参与，并通过多种途径相互协调作用，因此任何导致始基卵泡池缩小、卵泡耗竭加速、卵泡募集或功能异常的因素，均可发生卵巢早衰。近年研究表明POF基因调控可能与原癌基因有关[10，11]。

原癌基因是一类细胞内高度保守的正常基因,这类基因在正常细胞中的表达严格受时间、空间、程序的调控，通过其表达产物-蛋白质分子调节不同组织细胞增殖及分化。原癌基因c-erbB2属于孤儿受体，尚无特异性配体，但同样具有酪氨酸激酶活性，参与信号传导系统和细胞生长的调节。表皮生长因子受体(EGFR)是原癌基因c-erbBl所编码的跨膜糖蛋白，当EGFR和配体EGF结合后，催化多种底物酪氨酸残基磷酸化，可启动、催化与细胞生长增殖有关的生长过程。我们以往研究发现在原始卵泡启动生长过程中有c-erbB2 mRNA的表达，且随着卵泡发育逐渐增加，而且EGF可以上调c-erbB2 mRNA的表达，表明原癌基因c-erbB2在原始卵泡启动生长中起重要的促进作用[12,13]。本实验HE染色发现空白组卵巢卵泡生长活跃,可见较多的成熟和次级卵泡,颗粒细胞层次多，而早衰卵巢内极少次级卵泡和成熟卵泡(P<0.01)，可见较多闭锁卵泡(P<0.01)，卵泡的颗粒细胞层次明显减少，与文献结果一致[14,15]。免疫组化发现空白组ErbB2蛋白和EGFR蛋白阳性信号明显，主要位于卵母细胞胞膜上，为深棕色染色颗粒，实验组早衰卵巢则阳性表达极少。结果提示c-erbB2基因和EGFR可能参与了卵巢早衰中的卵泡成熟障碍及卵泡凋亡调控，但c-erbB2基因和EGFR具体通过何种途径影响早衰卵巢中卵泡的发育，还需进一步研究。

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