孙协军,李秀霞,吕艳芳,刘雪飞,田 鑫

(渤海大学化学化工与食品安全学院 辽宁省高校重大科技平台“食品贮藏加工及质量安全控制工程技术研究中心”,辽宁锦州 121013)

山楂中总三萜酸超高压提取工艺研究

孙协军,李秀霞*,吕艳芳,刘雪飞,田 鑫

(渤海大学化学化工与食品安全学院 辽宁省高校重大科技平台“食品贮藏加工及质量安全控制工程技术研究中心”,辽宁锦州 121013)

对山楂中总三萜酸含量和提取工艺进行研究,以齐墩果酸和熊果酸总得率为响应值,考查了乙醇体积分数、液固比、压力和保压时间对山楂总三萜酸得率的影响。结果表明,几个考查因素对山楂三萜酸得率影响的顺序为:乙醇体积分数>压力>保压时间>液固比;方差分析结果表明,乙醇体积分数和压力对三萜酸得率有极显著影响(p<0.01),保压时间对三萜酸得率有显著影响(p<0.05),乙醇体积分数、压力和保压时间的二次项对三萜酸得率有极显著影响(p<0.01),并且超高压压力和保压时间之间存在交互作用(p<0.05);确定超高压提取山楂三萜酸的最佳工艺参数为:乙醇体积分数73%,液固比33mL/g,压力383MPa,保压时间为11min,在优化工艺条件下超高压提取山楂三萜酸,其得率为2.81mg/g,与预测值相符。

山楂,齐墩果酸,熊果酸,超高压提取

山楂通常指蔷薇科植物山里红(CrataegusPinnatifidaBga.var.majorN.E.Br.)或山楂(CrataeguspinnatifidaBge.)的干燥成熟果实。其中,山里红也叫北山楂,在我国北方地区广泛栽培,是重要的药食同源植物[1]。山楂中含有多种活性成分,其中包括黄酮类、原花青素类、低聚黄烷类、有机酸类和三萜类等[2-3],三萜类化合物是山楂中的一类重要的功效成分,因为具有强心、增加冠脉血流和改善血流循环等作用而受到人们关注[4]。山楂酸(maslinic acid)、科罗索酸(corosolic acid)、齐墩果酸(oleanolic acid)和熊果酸(ursolic acid)为代表的五环三萜类物质是山楂中主要的三萜类化合物[5],山楂中含量最高的三萜类化合物为熊果酸[6],齐墩果酸是熊果酸的同分异构体,结构中仅有一个甲基的位置不同(结构式见图1所示),熊果酸和齐墩果酸具有抗炎、增强免疫、抗肿瘤、保肝和抗菌等重要生理功能[7]。

图1 齐墩果酸和熊果酸的结构式Fig.1 Structure of oleanolic acid and ursolic acid

齐墩果酸和熊果酸等三萜酸常用的提取方法主要有索氏提取、回流提取[8]、超声波提取[9]、微波辅助提取[10]等,采用超声波和微波辅助提取都能有效的缩短山楂三萜酸的提取时间,提高提取效率。研究报道超高压提取(UHPE)在熊果酸和齐墩果酸的提取中也具有很好的效果[11-12]。董海丽采用超高压技术提取木瓜中齐墩果酸,最佳压力为350MPa,保压时间4min,液固比20mL/g,木瓜齐墩果酸得率2.72%,同回流提取和超声提取方法相比,超高压提取方法得率高,提取时间短[11]。董海丽等采用超高压技术提取柿叶中熊果酸的最佳工艺参数为提取压力300MPa、提取时间4.0min、乙醇体积分数95%和液固比11mL/g,该条件下熊果酸提取率为0.43%,比超声波辅助提取法和微波辅助提取法的提取率分别提高了10.3%和16.2%[12]。综上所述,与常规回流等提取方法相比,采用超高压技术提取齐墩果酸和熊果酸具有提取效率高、时间短和能耗低的优点。本实验以自制山楂粉为原料,采用超高压辅助提取技术,对山楂中齐墩果酸和熊果酸这两种主要三萜酸的超高压辅助提取工艺进行研究,为超高压技术在三萜酸提取方面的应用提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

山楂 市售,产自辽西地区;齐墩果酸标准品(含量94.9%)和熊果酸标准品(含量99.3%) 购于中国药品生物制品检定所;高效液相色谱检测所用试剂均为色谱纯,水为超纯水,其它试剂为分析纯。

P680型高效液相色谱仪(配DAD检测器) 美国戴安公司;FA2004电子天平 上海恒平科学仪器有限公司;RE-2000旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;HPB.A2-600/0.4型超高压实验机 天津市森淼生物技术有限公司;SCIENTZ-ⅡD型超声波细胞破碎仪 宁波新芝超声设备有限公司;PS02-AD-DI超纯水机 上海讯辉环保科技有限公司;SHZ-D(Ⅲ)型循环水真空泵 上海申光仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 山楂样品预处理方法 选择整齐度良好的新鲜山楂自来水清洗后去除果核,带皮果肉部分在50℃热风烘干后粉碎成细粉,全部过40目分样筛后真空封装,冷藏备用。

1.2.2 山楂三萜酸提取方法 准确称取一定质量山楂粉于聚乙稀袋密封袋中,按照实验设计加入相应体积的提取溶剂混合后,封好袋口后放入超高压腔体内进行提取。超高压设备腔体采用去离子水作为流体媒介,升压速度为100MPa/min,降压为瞬间降压(约2～3s)。超高压处理后的混合液减压抽滤,等体积的提取溶剂洗涤抽滤瓶中滤渣,所得滤液在60℃旋转蒸发掉大部分溶剂后,依次用去离子水和三氯甲烷洗涤残余物多次,洗涤的混合液置于分液漏斗中静止分层,取下层的三氯甲烷部分,减压蒸干溶剂,体积分数90%甲醇定容提取液至10mL容量瓶中,0.45μm膜过滤后,HPLC检测2种三萜酸浓度,计算三萜酸总得率。

1.2.3 液相色谱检测条件色谱条件的确定 Develosil C30(250mm×4.6mm,5μm)色谱柱;流动相:甲醇∶0.04%磷酸水溶液(90∶10;v/v);流速1mL/min;柱温30℃;进样20μL;检测波长:202nm。

1.2.4 标准曲线的绘制 各取齐墩果酸和熊果酸标准品10.5mg和20mg,甲醇溶解并分别定容至25mL,得到浓度分别为0.42(齐墩果酸)和0.8(熊果酸)mg/mL的混合标准品贮备液,分别稀释为5个浓度梯度的标准使用溶液,浓度分别为:齐墩果酸,0.084、0.168、0.252、0.336和0.420mg/mL;熊果酸,0.16、0.32、0.48、0.64和0.80mg/mL。

1.2.5 山楂三萜酸得率的计算方法 三萜酸得率(mg/g)=(提取液中2种三萜酸浓度总和×定容体积)/称样质量

1.2.6 提取单因素实验设计 改变提取剂浓度、压力、乙醇溶剂与山楂粉的液固比、保压时间几项参数的条件,研究上述因素对山楂三萜酸得率的影响,为响应面实验确定影响因素和适合水平。

1.2.6.1 乙醇体积分数对山楂三萜酸得率的影响 准确称取10g山楂粉于密封袋中,分别加入体积分数分别为20%、30%、40%、50%、60%、70%和80%的乙醇溶液,封好袋口,固定液固比20mL/g,压力为400MPa,保压时间为5min,参照1.2.2所述方法进行超高压提取实验,计算三萜酸得率。

1.2.6.2 液固比对山楂三萜酸得率的影响 称取10g山楂粉于密封袋中,固定超高压实验机压力为400MPa,保压时间为5min,山楂粉和乙醇溶剂的液固比分别为10、15、20、25、30、35和40mL/g条件下提取,其余步骤参照1.2.2所述方法进行,计算山楂三萜酸得率。

1.2.6.3 压力对山楂三萜酸得率的影响 称取10g山楂粉于密封袋中,保压时间为5min,分别在300、350、400、450、500和550MPa压力下提取,其余步骤参照1.2.2所述方法进行,计算山楂三萜酸得率。

1.2.6.4 保压时间对山楂三萜酸得率的影响 称取10g山楂粉于密封袋中,分别采用保压时间为2.5、5、7.5、10、15和20min提取,其余步骤参照1.2.2所述方法进行,计算山楂三萜酸得率。

为进一步确定最佳超高压萃取条件和各因素的影响顺序,依据design-expert7.0进行响应面实验设计,以2种三萜酸总得率为考察指标,以乙醇体积分数(X1)、液固比(X2)、压力(X3)和保压时间(X4)为考查因素,共设立30个处理组,具体实验设计见表1。

表1 山楂三萜酸超高压辅助提取响应面实验设计

1.3 数据统计分析

实验数据采用excel2003和design-expert7.0数学软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 HPLC分离结果和标准曲线的建立

齐墩果酸和熊果酸是山楂中主要的2种三萜类化合物,互为同分异构体,在液相色谱上难于分离,以往报道中通常采用乙腈、甲醇和一定pH的水溶液为流动相,但色谱乙腈价格昂贵,不适合用于提取工艺参数的优化中,根据已有研究成果,以甲醇为流动相,采用0.04%磷酸调节流动相的pH,当0.04%磷酸比例为10%左右时,而流动相pH为3左右时,齐墩果酸和熊果酸的分离效果最好[15],因此,通过前期色谱分离条件筛选,本实验中最后选定的流动相为甲醇/0.04%磷酸水溶液(90∶10,v/v)。齐墩果酸和熊果酸混合标准溶液及山楂提取液的液相色谱图见图2和图3所示,保留时间为19.9min色谱峰为齐墩果酸,保留时间为21min左右色谱峰为熊果酸[15],以2种三萜酸浓度平均值(mg/mL)为横坐标,以峰面积为纵坐标,2条标准曲线的回归方程分别为:齐墩果酸,Y=231.2X-0.922(R2=0.9987;线性范围为0.084～0.420mg/mL);熊果酸,Y=567.3X-0.088(R2=0.9993;线性范围为0.16～0.80mg/mL)。

图2 三萜酸混合标准溶液色谱图Fig.2 Chromatogram of triterpene acid mixture standard

图3 山楂三萜酸提取液色谱图Fig.3 Chromatogram of hawthorn triterpene acid extract

2.2 乙醇体积分数对山楂三萜酸得率的影响

图4 乙醇体积分数对山楂三萜酸得率的影响Fig.4 Effect of ethanol volume fraction on yield of triterpene acid extracted from hawthorn

乙醇体积分数对山楂三萜酸得率的影响如图4所示,乙醇体积分数对三萜酸得率的影响较大,体积分数低于40%乙醇的提取效果很差,齐墩果酸和熊果酸不溶于水,可溶于甲醇、乙醇、氯仿、乙醚和丙酮中,从溶剂的毒性和成本考虑,选择不同体积分数乙醇为提取溶剂。从图4中可以看出,体积分数为70%的乙醇提取效果最好,之后,随着乙醇体积分数的增加,山楂三萜酸得率反而降低,这与回流提取和微波提取的结果略有差异,汪文浩等采用微波提取枇杷花中齐墩果酸和熊果酸,体积分数为80%乙醇的提取效果最好[14],黎海彬采用回流方法提取山楂熊果酸,体积分数为90%乙醇的提取效果最好[15],本实验中的结果与林海采用超高压技术提取山茱萸中熊果酸的实验结果相同[16],这间接说明,在400MPa左右的超高压压力作用下,山楂中齐墩果酸和熊果酸更易溶于体积分数相对较低的乙醇溶液中,这可能与在超高压的增压、保压和卸压过程中,山楂粉中蛋白质、淀粉等大分子物质结构变化,影响了三萜酸的浸出,而体积分数稍低的乙醇溶解分散性明显高于体积分数较高的乙醇溶液,因此,超高压提取可以选择极性相对较高的乙醇水溶液作为提取溶剂。在本实验中,选择体积分数为70%乙醇溶解进行下一步实验。

2.3 液固比对山楂三萜酸得率的影响

液固比对山楂三萜酸得率的影响如图5所示,随着液固比的增大,山楂三萜酸得率在一定范围内(液固比10～30mL/g)有增加的趋势,当液固比为30mL/g时,得率最高(0.92mg/g),其后,随着液固比的增加,山楂三萜酸得率呈现下降趋势。这主要是因为随着液固比的增加,物料内外三萜酸的浓度差增大,有利于传质作用,当液固比增大到一定值后,由于山楂中三萜酸的含量有限,三萜酸得率的增加趋于平缓,而随着液固比的增加,后继处理时间增长,在浓缩等过程中三萜酸的损失增加,因此,当液固比超过30mL/g后,随着液固比的继续增大,山楂三萜酸得率反而有下降的趋势,因此,选择液固比30mL/g进行下一步实验。

图5 液固比对山楂三萜酸得率的影响Fig.5 Effect of solvent to solid ratio on yield of triterpene acid extracted from hawthorn

2.4 压力对山楂三萜酸得率的影响

超高压实验机压力对山楂三萜酸得率的影响如图6所示,在压力为300～400MPa范围内,随着超高压压力的加大,山楂三萜酸得率从0.52mg/g增加到0.92mg/g,可见,在一定范围内(300～400MPa),超高压压力的增加有利于山楂三萜酸提取效率的提高,压力超过400MPa后,山楂三萜酸得率随着压力的增高而降低,当超高压压力达到550MPa时,山楂三萜酸得率降为0.68mg/g。董海丽采用超高压技术提取柿叶熊果酸,最佳压力为300MPa、提取时间4.0min、乙醇体积分数95%和液固比11mL/g,该条件下熊果酸提取率为0.43%[12]。纵伟采用超高压技术提取大花紫薇叶中2α-羟基熊果酸,最佳压力为300MPa,保压时间5min,乙醇体积分数90%,液固比15mL/g,提取次数3次,2α-羟基熊果酸得率为0.415%[17]。在本实验中,山楂齐墩果酸和熊果酸最佳提取压力为400MPa,乙醇体积分数为70%,这说明,较低浓度的乙醇溶液在较高的提取压力下才能达到理想的提取效果,固定超高压压力为400MPa进行下一步实验。

图6 超高压压力对山楂三萜酸得率的影响Fig.6 Effect of ultrahigh pressure on yield of triterpene acid extracted from hawthorn

2.5 保压时间对山楂三萜酸得率的影响

保压时间对山楂三萜酸得率的影响如图7所示,在保压10min以内,随着保压时间的增加,保压10min的山楂三萜酸得率(2.8mg/g)显著高于保压5min的三萜酸得率(0.92mg/g)(p<0.05),而当保压时间超过10min后,山楂三萜酸得率明显下降,说明长时间处于较高压力下,山楂三萜酸的损失增大,而此时,三萜类物质的浸出已经达到平衡,导致山楂三萜酸得率降低,因此,选择保压时间10min进行下一步实验。

图7 保压时间对山楂三萜酸得率的影响Fig.7 Effect of dwell time of UHPE on triterpene acid extracted from hawthorn

2.6 响应面实验结果

通过单因素实验,选取乙醇体积分数(X1)、液固比(X2)、压力(X3)和保压时间(X4)进行四因素三水平的响应面实验,实验设计的因素、水平和实验结果见表2。用Design-expert7.0软件对实验数据进行多元回归拟合,得到山楂中三萜酸得率的回归方程为Y=2.84+0.075X1-0.03X2+0.02X3+0.025X4-0.05X2X3+0.05X3X4-0.105X1X1-0.062X2X2-0.08X3X3-0.08X4X4。方差分析结果见表3所示,模型的F值极显著(p<0.01),而失拟的F值不显著(p>0.05),模型的相关系数R2为92.89%,说明模型拟合程度良好,可以用该模型方程来分析和预测不同超高压辅助提取条件下山楂三萜酸得率的变化。在所选的各因素水平范围内,乙醇体积分数(X1,%)和超高压压力(X3,MPa)对山楂三萜酸得率有极显著影响(p<0.01),保压时间(X4,min)对山楂三萜酸得率有显著影响(p<0.05),液固比(X2,mL/g)影响不显著(p>0.05),压力和保压时间之间存在交互作用(p<0.05),4个考查因素对山楂中三萜酸类化合物得率的影响排序为:乙醇体积分数>压力>保压时间>液固比。

表2 响应面实验结果及分析

2.7 交互作用分析

超高压实验机压力(X3,MPa)和保压时间(X4,min)之间存在一定的交互作用,响应面图和等高线图如图8所示,从图8中可以看出,压力和保压时间对山楂三萜酸得率均有较大影响,而在较低压力下保压较长时间弥补了超高压压力较低的不足,可获得相同的提取效率。

图8 压力和保压时间对山楂三萜酸得率影响的相应曲面图Fig.8 Response surface graph of total triterpene acid yield of hawthorn

2.8 最优提取工艺参数的优化

采用design expert7.0软件对工艺参数进行优化,得到的最佳工艺参数为:乙醇体积分数73%,液固比33mL/g,压力383MPa,保压时间为11min,山楂三萜酸得率预测值为2.87mg/g。在优化工艺条件下超高压提取山楂三萜酸,其得率为2.81mg/g,与预测值的相对误差为2.09%。

3 结论

3.1 以齐墩果酸和熊果酸总得率为衡量指标,考查了乙醇体积分数、压力、液固比和保压时间对山楂三萜酸得率的影响,在所选的各因素水平范围内,压力和保压时间之间存在一定的交互作用,4个考查因素对山楂三萜酸得率影响的主次顺序为:乙醇体积分数>压力>保压时间>液固比。

表3 方差分析结果

注:*.Prob>F小于0.05,模型或考察因素影响显著;**.Prob>F小于0.01,模型或考察因素影响极显著。

3.2 方差分析结果表明,乙醇体积分数和压力对三萜酸得率有极显著影响(p<0.01),保压时间对三萜酸得率有显著影响(p<0.05),乙醇体积分数、压力和保压时间的二次项对三萜酸得率有极显著影响(p<0.01),并且超高压压力和保压时间之间存在交互作用(p<0.05)。

3.3 建立了超高压辅助提取山楂三萜酸的数学模型,确定超高压辅助山楂三萜酸的最佳工艺参数为:乙醇体积分数73%,液固比33mL/g,压力383Mpa,保压时间为11min,在优化工艺条件下超高压提取山楂三萜酸,其得率为2.81mg/g。

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Optimization of extracting technique assisted by ultrahigh pressure extraction of total triterpene acid from hawthorn

SUN Xie-jun,LI Xiu-xia*,LV Yan-fang,LIU Xue-fei,TIAN Xin

(College of Chemistry,Chemical Engineering and Food Safety,Engineering and Technology Research Center of Food Preservation,Processing and Safety Control of Liaoning Province,Jinzhou 121013,China)

In order to investigate triterpenic acid content in hawthorn,the extracting technique assisted by ultrahigh pressure extraction method of triterpene acid from hawthorn was optimized. The total yield of oleanolic acid and ursolic acid was used as response value,ethanol volume percentage,L/S ratio,power,and retention time were investigated in this experiment. The results showed that the sequence of different factors on toatal triterpene acid yield was:ethanol volume percentage>power>dwell time>L/S ratio;the result of variance analysis showed that ethanol volume percentage and pressure had extremely significant effect on total triterpene acid yield(p<0.01),dwell time had a significant influence on total triterpene acid yield(p<0.05),ethanol volume percentage,pressure,and dwell time of the quadratic term had extremely significant effect(p<0.01),and there was interaction between ultrahigh pressure and dwell time(p<0.05);the optimal condition was that ethanol volume percentage 73%,L/S 33mL/g,ultrahigh pressure 383MPa,dwell time 11 min,under the optimal condition,the total triterpene acid yield of hawthorn was 2.81mg/g,which was consistent with the predicted value.

Hawthorn;oleanolicacid;ursolic acid;UHPE

2014-07-14

孙协军(1969-)，男，学士，实验师，主要从事食品资源开发利用方面的研究。

*通讯作者:李秀霞(1973-)，女，博士，副教授，主要从事水产品贮藏加工方面的研究。

“十二五”国家科技支撑计划(2012BAD29B06)；辽宁省食品安全重点实验室开放课题(LNSAKF2011015)。

TS219

B

1002-0306(2015)07-0208-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.036