李 奎,李雪玲

(安徽农业大学茶与食品科技学院,安徽合肥 230036)

响应面法优化碱液提取百蕊草多糖的工艺研究

李 奎,李雪玲*

(安徽农业大学茶与食品科技学院,安徽合肥 230036)

为了提高百蕊草的利用价值和经济价值,以百蕊草为原料,在单因素实验的基础上,采用了响应面法对碱液提取百蕊草多糖工艺进行了优化。结果表明,碱液提取百蕊草多糖的最佳工艺条件为:提取时间2h,提取温度95℃,料液比1∶33,氢氧化钠浓度为0.74mol/L。在此条件下,百蕊草多糖的得率为20.86%,与预测值20.66%拟合性较好。

响应面,碱液提取,百蕊草,多糖

百蕊草是檀香科植物,多生长于田野及山区沙地边缘中,我国南北各地均有分布。百蕊草具有抑菌、镇咳、消炎镇痛、抗氧化等多种生物活性[1-2],是一种广谱的抗菌中草药。近年来国内外关于百蕊草的研究重点大多集中在其生物学特性、抑菌成分的提取与性质研究及其开发利用等几个方面[3-4],而有关百蕊草多糖的提取分离工艺方面的研究却鲜见报道。多糖的提取方法有热水提取法、碱液提取法、超声波提取法、酶解法提取法等,碱液提取操作简单而且多糖得率高,是多糖提取较常用的方法之一。因此,优化百蕊草多糖的碱液提取工艺,将百蕊草中的多糖提取出来并添加到食品药品中,将大大提高百蕊草的利用价值和经济价值。

响应面分析法(Response Surface Methodology,RSM)是利用合理的实验设计,采用多元二次方程来拟合因素与响应值之间的函数关系,通过对回归方程的分析来确定最优工艺的一种分析方法[5]。RSM现已广泛的运用于农业、医药、食品、化学等多个领域,在食品领域主要用于发酵工艺和提取工艺的优化[6-7]。本文拟在单因素实验的基础上,利用响应面分析法对百蕊草多糖的提取工艺条件进行优化。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

百蕊草 购于合肥市安徽中医学院,经高速中药粉碎机粉碎后,过40目筛;95%乙醇、重蒸酚、浓硫酸、氢氧化钠等 均为国产分析纯。

DD-04四两装高速中药粉碎机 温岭市大海药材器械厂;GZX-9070MBE数显鼓风干燥箱 上海博讯实业有限公司;752紫外可见分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 百蕊草的前处理 将百蕊草置于15倍体积石油醚中浸泡24h脱脂,再用10倍体积95%乙醇浸泡过夜去黄酮,最后置于烘箱中80℃烘干,将烘干后的百蕊草粉碎后过40目筛,得到百蕊草粉末备用。

1.2.2 多糖含量的测定 文章采用苯酚硫酸法测定多糖含量[8]。

1.2.2.1 标准曲线的绘制 精密称取于105℃烘干至恒重的葡萄糖50mg,用蒸馏水溶解并定容到50mL,作为储备液待用。精密量取葡萄糖储备液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL,分别置于50mL容量瓶中并定容,摇匀。分别量取上述各溶液2mL,各加入6%苯酚1.0mL,摇匀,迅速加入浓硫酸5.0mL,迅速摇匀,放置5min后置沸水浴加热15min取出,冷水迅速冷却至室温;精密量取蒸馏水2.0mL,同样操作,作为空白对照,按分光光度计法在490nm波长处测定吸光度,测定三次,取其平均值。以吸光值(A)对浓度(C)作回归计算,绘制标准曲线。

1.2.2.2 碱液提取百蕊草多糖的工艺流程 百蕊草粉末→碱液提取→离心取上清液→旋转蒸发浓缩→乙醇沉淀多糖(三倍体积的95%乙醇浸泡过夜)→离心取沉淀→溶解、流水透析48h→冷冻干燥→百蕊草粗多糖。

1.2.2.3 百蕊草多糖含量计算 C=(A-0.0198)/11.894×B×F

式中:C-样品浓度(mg/mL);A-样品的吸光值;B-稀释倍数;F-换算因子(F=2.2889)[9]。

1.2.2.4 百蕊草多糖得率计算 百蕊草多糖得率(%)=(C×V/样品质量)×100

式中:C-样品浓度(mg/mL);V-提取液体积(mL)。

1.2.3 单因素实验 准确称取0.5g百蕊草粉末5份,分别置于50mL具塞刻度管中,考察料液比、提取温度、提取时间、氢氧化钠浓度对百蕊草多糖得率的影响。

1.2.3.1 料液比对百蕊草多糖得率的影响 准确称取0.5g百蕊草粉末5份,分别置于50mL具塞刻度管中,在提取时间1.5h,氢氧化钠浓度为0.7mol/L,提取温度80℃,料液比分别为1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40g/mL的条件下提取百蕊草多糖,测定多糖的得率。

1.2.3.2 提取温度对百蕊草多糖得率的影响 准确称取0.5g百蕊草粉末5份,分别置于50mL具塞刻度管中,在提取时间1.5h,氢氧化钠浓度为0.7mol/L,料液比为1∶30g/mL,提取温度分别为60、70、80、90、100℃的条件下提取百蕊草多糖,测定多糖的得率。

1.2.3.3 提取时间对百蕊草多糖得率的影响 准确称取0.5g百蕊草粉末5份,分别置于50mL具塞刻度管中,在提取时间1.5h,氢氧化钠浓度为0.7mol/L,料液比为1∶30g/mL,提取温度80℃,提取时间分别为1、1.5、2、2.5、3h的条件下提取百蕊草多糖,测定多糖的得率。

1.2.3.4 氢氧化钠浓度对百蕊草多糖得率的影响 准确称取0.5g百蕊草粉末5份,分别置于50mL具塞刻度管中,提取时间1.5h,料液比为1∶30g/mL,提取温度80℃,氢氧化钠浓度分别为0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mol/L的条件下提取百蕊草多糖,测定多糖的得率。

1.2.4 响应面分析 在单因素实验的基础上,根据Box-Benhnken的中心组合实验设计原理,以料液比、提取温度、提取时间、氢氧化钠浓度为自变量,百蕊草多糖的得率为响应值,利用响应面分析法优化碱液提取百蕊草多糖的工艺条件。响应面因素和水平选取见表1。

表1 响应面实验因素水平编码表

1.2.5 数据统计分析 将得到的实验结果利用Excel、Design-Expert 8.0进行直观分析和方差分析。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖的标准曲线

由图1可以看出,在测定范围内,葡萄糖浓度和吸光值之间呈良好线性关系,线性方程为y=11.894x+0.0198,相关系数R2=0.9956。

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 The standard curve of glucose

2.2 单因素实验

2.2.1 料液比对百蕊草多糖得率的影响 对于提取工艺来说,料液比是考察的重点[10-11]。过低的料液比会导致浸提液与样品接触不彻底使多糖不能完全溶出,过高的料液比会造成浪费而且给下一步的分离纯化带来麻烦。从图2可以看出料液比增加到1∶30g/mL后多糖的得率没有太大的变化,因此最佳料液比选择1∶30g/mL。

图2 料液比对得率的影响Fig.2 The effect of different ratio of alkaline liquor to raw material on the yields

2.2.2 提取温度对百蕊草多糖得率的影响 从图3可以看出,随着温度的升高,百蕊草多糖得率的变化也呈现先迅速增加后逐渐减缓的趋势。这可能是因为在过高的温度条件下,碱性溶液中的多糖易发生分解和碳链断裂,故最佳温度选择90℃。

图3 提取温度对得率的影响Fig.3 The effect of different extraction temperature on the yields

2.2.3 提取时间对百蕊草多糖得率的影响 从图4可以看出,多糖得率在提取时间2h达到最高值,然后随着进一步延长提取时间得率迅速下降。这说明多糖溶于提取液是一个缓慢的过程,时间过短,多糖提取不彻底;而时间过长会引起多糖结构的破坏,导致得率降低。因此最佳提取时间为2h。

图4 提取时间对得率的影响Fig.4 The effect of different extraction time on the yields

2.2.4 氢氧化钠浓度对百蕊草多糖得率的影响 从图5可以看出,氢氧化钠浓度为0.7mol/L是转折点。当氢氧化钠浓度大于0.7mol/L后,百蕊草多糖的得率迅速降低。碱液浸泡能解除细胞壁聚合物之间的物理作用,有助于多糖从细胞内溶出,从而提高多糖得率。但过高的碱液浓度会发生β-消去反应,引起多糖结构的破坏,多糖得率也随之降低[12]。

图5 氢氧化钠浓度对得率的影响Fig.5 The effect of different NaOH concentration on the yields

2.3 响应面优化分析

Box-Benhnken实验设计及结果见表2,通过软件进行非线性回归的二次多项式的拟合,得出二次回归方程如下:

Y=-294.43208+0.79207A+2.97038B+70.64933C+240.34833D-0.0059AB+0.34AC+2.325AD-0.163BC-0.1425BD+2.6CD-0.040423A2-0.012281B2-16.81733C2-207.93333D2。

由表3可以看出,模型的p值<0.0001,说明该模型显著,失拟项p值为0.6167>0.05不显著。该模型的相关系数R2为93.18%,调整后为86.37%,说明该模型能解释86.37%的响应值的变化[13],证明该模型与实际的拟合性较好。

表2 Box-Benhnken实验设计及结果

方差分析可知,提取时间对得率的影响不显著,料液比对得率的影响显著,提取温度和氢氧化钠浓度对得率的影响极显著;料液比与氢氧化钠浓度之间交互作用显著,其余各因素之间的交互作用均不显著;料液比的二次项对得率的影响显著,提取温度、提取时间、氢氧化钠浓度三者的二次项对得率的影响极显著。由此可以看出,各因素对得率的影响不是简单的线性关系。

各因素的F值表示各因素对响应值的影响程度,F值越大表示该因素对响应值的影响越大[14]。从表3可以看出各因素对得率的影响大小排列分别为提取温度>氢氧化钠浓度>料液比>提取时间。

表3 回归方程方差分析表

注:**表示极显著(p<0.01);*表示显著(0.01

由回归方程得出拟合的料液比与氢氧化钠浓度对得率的影响的响应面图见图6。图6表示了当提取温度和提取时间为零水平时,料液比和氢氧化钠浓度对百蕊草多糖得率的影响。响应曲面的陡峭程度反映了因素对响应值的影响力大小,也表明了因素间交互作用的强弱。由图6可知,料液比与氢氧化钠浓度之间的交互作用显著。

图6 料液比与氢氧化钠浓度的响应面立体图Fig.6 Response surface plot showing the effects off the material ratio and NaOH concentration on dried osmund dietary fiber alkaline hydrolysis

2.4 最佳工艺条件的预测和验证

根据该模型预测出理论条件下碱液提取百蕊草多糖的最佳工艺条件为:料液比1∶32.66g/mL,提取温度95.35℃,提取时间2.03h,氢氧化钠浓度0.74mol/L,百蕊草多糖的得率为20.66%。考虑到实际生产操作,将最优工艺条件修正为:料液比1∶33g/mL,提取温度95℃,提取时间2h,氢氧化钠浓度0.74mol/L,经验证此条件下百蕊草多糖的实际得率20.86%,与预测值的相对偏差小于1%。因此,基于响应面法得到的优化提取工艺参数准确可靠,有实用价值。

3 结论

文章在单因素实验的基础上,通过响应面实验设计对碱液提取百蕊草多糖的工艺进行了优化,结果表明料液比、提取温度、提取时间、氢氧化钠浓度四个因素对百蕊草多糖得率的影响大小为:提取温度>氢氧化钠浓度>料液比>提取时间,最佳工艺条件为料液比1∶33g/mL,提取温度95℃,提取时间2h,氢氧化钠浓度0.74mol/L,此条件下百蕊草多糖的得率高达20.86%。本研究为百蕊草的开发利用提供了科学依据,具有重要的现实意义。

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Study on response surface methodology for alkali extraction of polysaccharide from thesium

LI Kui,LI Xue-ling*

(College of Tea and Food Science and Technology,Anhui Agriculture University,Hefei 230036,China)

In order to improve the use value and economic value of Thesium,Thesium was used as raw materials.Based on the single factor experiment,the alkali extraction process of polysaccharide Thesium were optimized by response surface methodology. The results showed that the optimal extraction conditions were:extraction time 2h,extraction temperature 95℃,solid-liquid ratio 1∶33,the concentration of sodium hydroxide for 0.74mol/L. Under this condition,Thesium polysaccharide yield was 20.86%,which fits well with the predicted value 20.66% .

response surface;alkaline liquor extraction;thesium;polysaccharides

2014-07-10

李奎(1991-),男,硕士研究生,研究方向:食品加工与安全。

*通讯作者:李雪玲(1972-),女,硕士，副教授,研究方向:食品营养与质量安全。

TS211.9

B

1002-0306(2015)07-0204-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.035