陈乃东,李 俊,金 晖,陈 琼,朱庆杰

(1.皖西学院生物与制药工程学院,安徽六安 237012;2.皖西中药与天然药物工程技术研究中心,安徽六安 237012;3.安徽医科大学药学院,安徽合肥 230032)

HPLC-UV-CL联用研究霍山石斛生物碱清除自由基活性

陈乃东1,2,3,李 俊3,*,金 晖1,陈 琼1,朱庆杰1

(1.皖西学院生物与制药工程学院,安徽六安 237012;2.皖西中药与天然药物工程技术研究中心,安徽六安 237012;3.安徽医科大学药学院,安徽合肥 230032)

目的:霍山石斛生物碱抗氧化活性成分在线测定,为霍山石斛药效物质基础研究及抗氧化活性物质快速发现提供依据;方法:在预实验基础上建立霍山石斛生物碱部位HPLC-UV分析方法,采用鲁米诺-双氧水发光体系作为羟自由基供体、以校正清除率为抗氧化活性评价标准,HPLC-UV-CL联用在线测定霍山石斛生物碱部位各组分清除羟自由基活性。以磷钼酸、碘-碘化钾为沉淀试剂敲出总生物碱提取物中生物碱组份,对比敲出前后HPLC图谱变化,确定霍山石斛的生物碱组分。结果:在本实验条件下,霍山石斛中检出4种生物碱峰6、峰10、峰11、峰14,其中峰14、峰11具有一定的清除羟自由基活性,校正清除率达4.95%和10.94%。峰6、峰10对鲁米诺-双氧水系统发光值无明显影响。结论:HPLC-UV-CL可用于霍山石斛生物碱清除自由基活性快速测定。

霍山石斛,高效液相-化学发光联用,清除羟自由基活性,生物碱

3.School of Pharmacy,Anhui Medical University,Hefei 230032,China)

霍山石斛(DendrobiumhuoshanenseC. Z. Tang et S. J. Cheng),俗称米斛,为兰科石斛属多年生草本植物,局限分布于大别山区的安徽霍山、金寨、岳西、舒城,湖北英山等县,含有多糖[1]、生物碱[2]和黄酮[3]等,具有增强免疫活性[4-5]、明目、抗氧化等功效[6],为安徽道地药材之一。

大量研究表明中药的许多功效与其抗氧化作用密切相关[7-8],快速发现中药中抗氧化活性成分对于阐明中药的作用机制和中药新药创制具有重要意义。传统中药活性物质的发现多采用先分离得到的单一化合物再进行活性测定的方式,然而,这种先分离再测定活性的方法盲目性较大,研究成果的取得带有很大的偶然性,效率极为低下。针对上述弊端,本实验拟从霍山石斛抗氧化活性入手,采用HPLC-UV-CL联用对霍山石斛总生物碱提取物抗氧化活性在线测定以快速发现霍山石斛中存在的抗氧化活性物质,为后续的抗氧化活性物质的定向分离、霍山石斛的谱效关系及临床应用提供理论依据,为探讨新的中药质量评价模式提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

实验材料霍山石斛,2013年10月采自安徽霍山,品种经植物细胞工程安徽省工程技术研究中心陈乃富教授鉴定为霍山石斛(DendrobiumhuoshanenseC. Z. Tang et S. J. Cheng)。

甲醇 AR,上海振兴化工一厂;色谱甲醇 上海星可生化有限公司;色谱乙腈 上海星可生化有限公司;磷酸 上海振起化学试剂有限公司;二乙胺 汕头市西陇化工厂有限公司;二氯甲烷,三氯甲烷 西陇化工股份有限公司;磷钼酸,雷氏铵盐,碘化钾 国药集团化学试剂有限公司;碘化汞钾 贵州铜仁化学试剂厂出品。

高效液相色谱仪:Waters1525 HPLC色谱仪(Breeze工作站、Waters2487双通道紫外检测器,美国);化学发光仪 西安瑞迈。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的制备 60℃烘干至恒重的霍山石斛,粉碎,精密称取10.0g,放入圆底烧瓶中,加入95%甲醇溶液50mL,60℃水浴冷凝回流浸提3次,每次3h,合并滤液,减压浓缩至干,残渣溶于5%的盐酸溶液,等体积二氯甲烷萃取3次,酸水相加氨水调pH至10.0,等体积氯仿萃取3遍,回收氯仿获总生物碱提取物,溶于色谱甲醇配成2.5mg/mL溶液,0.45μm微孔滤膜过滤、备用。

1.2.2 HPLC-UV-CL在线分析中HPLC条件 参照相关文献[9],经过反复预实验,确定霍山石斛总生物碱HPLC检测条件为:Kromasil ODS C18柱;流动相0.02mol/L二乙胺溶液(A相)-乙腈(B相),梯度洗脱,0～8.0min,20% B,8.0～10.0min,20%～30% B,10.0～17.0min,30% B,17.0～30.0,30%～45% B,30.0～33.0min,45%～50%,33.0～40.0min,50% B,40.0～42.0min,50%～65% B,42.0～48.0min,65% B,48.0～50.0min,65%～80% B,50.0～57.0min,80% B,57.0～60.0min,80%～100% B,60.0～73.0min,100% B,73.0～76.0min,100%～20% B,76.0～86.0min,20% B,流速0.6mL/min;检测波长240nm;柱温25℃;进样量20μL。

1.2.3 HPLC-UV-CL在线分析中CL条件 参考余伯阳[10-12]、李萍[13]等方法,在前期实验基础上[14],采用鲁米诺-双氧水发光体系在线评价霍山石斛生物碱部位清除羟自由基活性。主要测定条件如下:

碳酸盐缓冲液:0.1mol·L-1NaHCO3水溶液以0.1mol·L-1Na2CO3碳酸钠水溶液调pH至10.0,0.45μm微孔滤膜过滤、备用。

H2O2溶液:精密量取30% H2O2溶液加双蒸水稀释成1.0×10-5mol/L的H2O2溶液0.45μm微孔滤膜过滤、备用。

鲁米诺溶液:精密称取鲁米诺碳酸盐缓冲液稀配制成1.8×10-5mol/L鲁米诺溶液,0.45μm微孔滤膜过滤、备用。

以双蒸水为空白对照。

1.2.4 抗氧化活性计算方法 在丁晓萍等[10]方法的基础上,实验采用校正清除率评价HPLC-UV-CL在线测定时各组分对羟自由基的清除能力,校正清除率指HPLC分离的组分峰,其1%峰面积所代表的质量对自由基的清除活性,计算方法如下:

校正清除率(%)=(CL空白-CL本底)-(CL样品-CL本底)/(CL空白-CL本底)×(Area%×100)×100

式中,CL空白为空白对照组的相对发光强度;CL本底为本底组的相对发光强度;CL样品为样品组的相对发光强度;Area%为HPLC样品峰的峰面积比例。校正清除率越高,表明样品清除自由基能力越强。

1.2.5 霍山石斛生物碱组分的沉淀敲除——生物碱组分定性分析 实验采用磷钼酸、碘-碘化钾[15]作为霍山石斛生物碱的沉淀试剂,精密吸取配制的2.5mg/mL总生物碱部位溶液0.5mL,与沉淀试剂等体积混合,摇匀,10℃下10000r/min离心10.0min,上清液即为敲除了生物碱组份的总生物碱提取液,与2.1测定的总生物碱提取物的HPLC结果相比较,确定霍山石斛生物碱组份峰。

2 结果与分析

2.1 霍山石斛总生物碱提取物的HPLC-UV检测结果

霍山石斛总生物碱提取物的HPLC结果如图1所示。在本实验条件下,HPLC谱上显示15个组分峰(peak1～peak15),但无法确定生物碱组份峰。

图1 霍山石斛总生物碱部位HPLC特征图谱Fig.1 The reference standard chromatograms of total alkloid extraction from the stems of D. huoshanese

2.2 霍山石斛总生物碱提取物生物碱组分的定性分析

样品加入沉淀试剂磷钼酸后(图2b),与未加沉淀试剂时霍山石斛HPLC图谱(图2a)及沉淀试剂磷钼酸空白(图2c)对照对比,HPLC色谱峰6的AU值显著降低;色谱峰10、峰11、峰14信号消失,提示霍山石斛生物碱部位的HPLC组分峰中的峰6、峰10、峰11、峰14可能为生物碱组分峰(图2)。

图2 霍山石斛生物碱部位生物碱组分磷钼酸沉淀敲出结果Fig.2 The HPLC chromatograms of knocked-out alkloids extraction from D. huoshanese by phosphomolybdic acid注:a.霍山石斛总生物碱部位HPLC图谱;b.霍山石斛总生物碱部位以磷钼酸沉淀敲除生物碱后HPLC图;c.磷钼酸空白对照。

沉淀试剂碘-碘化钾对霍山石斛生物碱组分沉淀敲出结果如图3b所示,与霍山石斛生物碱部位HPLC图谱(图3a)、沉淀试剂空白(图3c)对照对比,生物碱部位HPLC图谱色谱峰6、峰10、峰11、峰14消失,与磷钼酸沉淀敲出结果一致,证明为HPLC图谱色谱峰6、峰10、峰11、峰14为霍山石斛的生物碱组分峰(图3)。

图3 霍山石斛生物碱部位生物碱组分碘-碘化钾沉淀敲出结果Fig.3 The HPLC chromatograms of knocked-out alkloids extraction from D. huoshanese by iodine-potassium iodide注:a.霍山石斛总生物碱部位HPLC图谱;b.霍山石斛总生物碱部位以碘-碘化钾沉淀敲除生物碱后HPLC图;c.磷钼酸空白对照。

2.3 霍山石斛总生物碱提取物的HPLC-UV-CL在线检测结果

分析CL图谱与HPLC图谱,HPLC检出霍山石斛总生物碱提取物检出的15种组分,对化学发光强度的影响存在明显差异(图4):在本实验条件下,仅有8个组分(峰1、峰3、峰4、峰11、峰12、峰13、峰14、峰15)可使鲁米诺-双氧水系统化学发光强度下降,有7个组分峰(峰2、峰5、峰6、峰7、峰8、峰9、峰10)未检测到明显的发光抑制活性,提示霍山石斛生物碱部位15种成分对羟自由基清除能力存在差异。8个发光抑制组分对鲁米诺-双氧水系统中羟自由基的校正清除率如表1所示。组分峰4对羟自由基的校正清除率最高,达14.81%,其次是峰14,校正清除率达10.94%。

值得注意的是,CL峰16′,在HPLC上并未检测到相应的组分峰16,可能是峰16所代表的物质在本实验设定的HPLC-UV色谱条件(λ=240nm)下无吸收所致,提示HPLC-UV-CL在线测定活性时波长选择对结果会产生影响。

表1 霍山石斛生物碱部位各组分清除羟自由基活性HPLC-UV-CL在线测定结果

图4 霍山石斛HPLC-UV-CL测定结果Fig.4 Chromatographic and antioxidant activity fingerprints of scavenging H2O2

综合HPLC-UV-CL检测结果及霍山石斛生物碱组分沉淀敲出结果,本实验条件下,可从霍山石斛中检测到4种生物碱(峰6、峰10、峰11、峰14),其峰面积比例从大到小依次为峰6、峰10、峰11、峰14,其中峰6峰面积最大,约为峰14的6倍。4种霍山石斛生物碱对鲁米诺-双氧水系统的羟自由基表现出不同的清除活性,峰14生物碱活性最强,对羟自由基的校正清除率达10.94%,而含量较高的峰6和峰10所代表的生物碱未检测到明显的羟自由基清除活性。

3 结论与讨论

采用HPLC-UV-CL在线测定中药提取物的活性,如何评价HPLC分离的各组分——尤其是未知组分的活性是一难题。HPLC分离的组分中,在CL谱上对发光抑制高的组分,其抗氧化活性不一定高,因为CL测定的是HPLC分离的组分总抗氧化活性,CL测定的发光抑制强度高的组分可能由于该组分含量高所致,在以CL发光抑制在线评价HPLC组分活性时,应考虑各组分的含量对活性的影响。实验引入校正清除率的概念,采用各组分的1%峰面积对自由基的清除率作为在线评价物质活性的指标,对于母核结构相似、在选定的检测波长下摩尔消光系数相近的物质,校正清除率大小反映了物质抗氧化活性大小。本实验采用校正清除率用于霍山石斛中不同生物碱组分的清除自由基活性进行在线评价,结果基本能反映各组分的抗氧化活性差异。采用HPLC-UV-CL在线测定方法,以校正清除率为评价指标,可从含有结构类似物的中药中快速发现抗氧化活性物质。然而,对于化学结构及消光系数相差较大的组分,峰面积相同的两个组分,其代表的物质含量相差较大,以峰面积大小代表不同物质含量,误差较大,导致校正抑制率评价抗氧化活性误差也较大,因此,HPLC-UV-CL不适宜结构、消光系数相差较大的化合物抗氧化活性比较。

霍山石斛虽长期用于医药保健,由于濒临灭绝,对其药效物质基础研究因缺乏实验材料而尚处于起步阶段,作为石斛类药材主要活性成分之一的生物碱,在霍山石斛含量极低,仅为其干重的0.03%[16],目前尚未有从霍山石斛中分离到生物碱类化合物研究报道,导致霍山石斛品质研究、甚至质量标准构建因缺乏标准对照品而陷于困境。因此,我们对霍山石斛生物碱部位的各组分抗氧化活性在线测定结果对于探讨霍山石斛的药效物质基础、快速发现抗氧化活性成分及阐明霍山石斛药物作用机制具有重要参考价值,为构建可反映霍山石斛化学成分指纹特征,又体现生物活性信息的综合质量评价体系提供前期研究基础。

此外,在本实验中,我们首次尝试将生物碱沉淀鉴定用于中药提取物中生物碱组分定向敲除,并与HPLC检测相结合,通过对比沉淀前后HPLC组分峰的变化确定霍山石斛未知生物碱组分,该方法对缺乏生物碱标准品的珍稀濒危中草药未知生物碱的定性分析及基于生物碱的天然药物质量控制具有一定参考价值。

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Cleaving hydroxyl radicals activity of the alkaloids fromDendrobiumhuoshanenseC. Z. Tang et S. J. Cheng detected by on-line HPLC-UV-CL system

CHEN Nai-dong1,2,3,LI Jun3,*,JIN Hui1,CHEN Qiong1,ZHU Qing-jie1

(1.College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,West Anhui University,Lu’an 237012,China;2. West Anhui Biotechnology Research Center of Natural Medicine and Traditional Chinese Medicine,West Anhui University,Lu’an 237012,China;

Objective:To explore the on-line detecting on the anti-oxidant activity of the alkaloids from the stems ofDendrobiumhuoshanenseC. Z. Tang et S. J. Cheng by HPLC-UV-CL system,and provide references on researching the potency material base ofD.huoshanenseand on quick discovery of antioxidants from Traditional Chinese Medicine. Method:Applying the on-line HPLC-UV-CL analysis with Luminol-perhydrol chemiluminescence system as the donor of hydroxyl radicals to evaluate the anti-oxidant activity of the constituents of the total alkaloid extraction fromD.huoshanense. The alkaloids were identified by knocking-out the alkaloid components using phosphomolybdic acid and iodine-potassium iodide as precipitation reagent. Result:Total four kinds ofD.huoshanensealkaloids(the HPLC peak 6,peak 10,peak 11 and peak 14)were checked out and peak 14 and peak 11 showed remarkable hydroxyl-radical-cleaning activity with the calibration clearance values 10. 94% and 4.95%,respectyively. No effect of the other twoD.huoshanensealkaloids(peak 6 and peak 10)on the chemiluminescence value of Luminol-perhydrol system were determined by the established on-line HPLC-UV-CL method. Conclusion:The on-line HPLC-UV-CL system could be used to evaluate the cleaving hydroxyl radicals activity ofD.huoshanensealkaloids.

Dendrobiumhuoshanense;cleaving hydroxyl radicals activity;chemiluminescence(CL);alkaloids

2014-06-13

陈乃东(1972-)，男，博士，副教授，主要从事天然药物活性成分分离鉴定、中药与天然药物质量标准与质量控制研究。

*通讯作者:李俊(1960-)，男，博士，教授，主要从事抗炎免疫药理学、临床药理学、生物药剂学和天然药物活性研究。

国家自然科学基金(81274021);中国博士后基金(2014M551791);安徽省人事厅博士后研究项目;安徽高校省级科学研究重点项目(KJ2012A277);六安市定向委托皖西学院市级研究重点项目(2011LWA001);皖西学院研究性学习项目(WXXYX2013063，WXXYX2013055，WXXYX2013080)。

TS201.2

A

1002-0306(2015)07-0276-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.050