何春鹏 管 锐 田 田 陆祖宏

(东南大学生物科学与医学工程学院,南京210096)(东南大学生物电子学国家重点实验室,南京210096)

文昌鱼内胚层发育相关核心调控基因的表达

何春鹏 管 锐 田 田 陆祖宏

(东南大学生物科学与医学工程学院,南京210096)(东南大学生物电子学国家重点实验室,南京210096)

研究了脊椎动物内胚层发育的核心调控基因Sox2,Pdx1和Cdx1在文昌鱼胚胎发育过程中的表达形式．结果显示:与脊椎动物相比,Sox2基因在文昌鱼前肠内胚层的表达区域具有较大的阴性范围,这一阴性区域与文昌鱼的鳃弓原基相对应,说明原索动物的内胚层衍生鳃弓与脊椎动物的神经脊鳃弓在演化上并不具备器官层次的同源性;文昌鱼Pdx1基因阳性的前-中肠消化内胚层的表达状态与脊椎动物高度同源,对应于盲囊的内胚层发育原基,说明文昌鱼盲囊与脊椎动物的胰腺具有演化同源关系;Cdx1基因的表达状态也与脊椎动物高度同源,说明脊椎动物的复杂肠道系统是从较为简单的后肠器官演化而来的.

核心调控基因;机体建构模式;内胚层;文昌鱼

脊索动物门分为头索动物亚门、尾索动物亚门和脊椎动物亚门等3个亚门;其中的前两者合称为原索类群,被定义为脊索动物门的祖先类型[1].原索类群中,文昌鱼为代表性物种,其内胚层衍生生理结构相对简单.文昌鱼的前肠内胚层主要参与口、鳃和内柱(甲状腺)的发育形成,中肠内胚层主要参与盲囊的发育形成,后肠内胚层主要参与肠道的发育形成.比较基因组学研究表明,文昌鱼的基因组极其保守,且5亿多年来形态变化缓慢,是探索脊椎动物机体建构模式演化起源的良好素材[2-3].因此,本文选取白氏文昌鱼为研究对象,以机体建构模式和演化-发育生物学为出发点,通过研究Sox2,Pdx1和Cdx1三种基因在文昌鱼胚胎发育过程中的表达状态,探索脊椎动物内胚层相关衍生结构的演化起源.

1 试验与方法

1.1 样本来源

1.2 基因扩增

从文昌鱼胚胎中提取总RNA,应用RNA逆转录试剂盒合成单链c-DNA文库.以Primer3软件在线设计相关引物,利用预混合Taq酶扩增基因.

1.3 信息分析

利用Mega6.0软件,对相关基因进行演化系统发生树分析,并注释保守结构域,同时进行种间序列差异分析及T7/Sp6电子定向分析.

1.4 原位杂交

以序列正确的基因为模板,合成RNA探针,对文昌鱼胚胎进行整体原位杂交试验,具体方法见

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文献[2].

1.5 图像采集

基于Olympus IX81平台,利用微分干涉系统,采用冷CCD法拍摄试验结果.

2 结果与分析

2.1Sox2基因在文昌鱼前肠内胚层的表达状态

图1为文昌鱼Sox2基因的演化同源性分析.结果显示,文昌鱼的Sox2基因与脊椎动物的Sox2基因在演化上高度同源,其核心结构域高度保守.

图1 Sox2基因的演化同源性分析

(a) T=12～14 h,早期神经胚

(b) T=14 h,生长期神经胚

(c) T=16 h,生长期神经胚

(d) 开口阶段胚胎

图2为文昌鱼Sox2基因的表达状态图.由图可知, 对生长期T=12～14 h的早期神经胚,Sox2基因主要集中表达在中-后神经管处,参与调控中枢神经系统的发育形成.T=14 h时,Sox2基因开始调控前肠内皮层的发育.T=16 h时,Sox2基因进入发育调控最繁忙期,在原有基础上开始调控中-前肠消化内胚层的发育.当文昌鱼胚胎发育至开口阶段,Sox2基因在前肠内胚层主要集中于调控口的发育,对中枢神经系统的调控作用结束,对中-前肠内胚层的调控作用也开始减弱.现有研究表明,在脊椎动物内胚层的发育过程中,Sox2基因在前-中肠内胚层的表达具有广泛的连续性,从内胚层前端一直分布到中-前肠内胚层分界线处,与Pdx1基因的表达范围紧密衔接[4-5].但Sox2基因在文昌鱼前肠内胚层的表达区域却具有较大的阴性区,其对应的是文昌鱼的鳃弓原基. 这表明原索动物的内胚层衍生鳃弓与脊椎动物的神经脊鳃弓在演化上并不具备器官层次的同源性,由神经脊细胞主导的外胚层鳃弓的演化出现是脊椎动物机体建构模式建立的主要标志之一.

2.2 Pdx1基因在文昌鱼前-中肠消化内胚层的表达状态

图3为文昌鱼Pdx1基因的演化同源性分析.结果显示,文昌鱼的Pdx1基因与脊椎动物的Pdx1基因在演化上高度同源,其核心结构域高度保守.

图3 Pdx1基因的演化同源性分析

(a) 早期神经胚

(b) T=16 h,生长期神经胚

(c) T=18 h,生长期神经胚

图4为Pdx1基因的表达状态图.由图可知,早期神经胚的Pdx1基因仅集中表达在第一色素点的原基细胞群中, 这一现象与Pdx1基因在玻璃海鞘的同时期表达状态相似[6].当第一色素点逐渐发育形成后,在从T=16 h(生长期神经胚)到开口时期这一广泛的时空跨度内,Pdx1基因集中表达在前-中肠消化内胚层中.类似于Nkx2.5基于与心脏[7-8]、FoxN1基因与胸腺的发育调控关系[9],Pdx1基因是脊椎动物胰腺发育的核心调控基因.文昌鱼Pdx1基因阳性的前-中肠消化内胚层对应于盲囊的内胚层发育原基.现有研究已表明,脊椎动物肝脏的发育标志基因Hhex仅在文昌鱼的内柱(甲状腺)中表达[10].因此,文昌鱼的盲囊与脊椎动物的胰腺(而非肝脏)同源.脊椎动物的胰腺比肝脏演化出现得更早,在脊椎动物机体建构模式形成之前,其祖先已拥有了简单的胰腺组织;而肝脏与神经脊鳃弓类似,其演化出现是脊椎动物机体建构模式正式确立的重要标志之一.

2.3 Cdx1基因在文昌鱼后肠消化内胚层的表达状态

图5为文昌鱼Cdx1基因的演化同源性分析.结果显示,文昌鱼的Cdx1基因与脊椎动物的Cdx1基因在演化上高度同源,其核心结构域高度保守.

Cdx1基因的表达相对简单.图6(a)显示,在早期神经胚中,Cdx1基因主要集中于神经管的尾部表达.由图6(b)～(d)可知,从T=16 h(生长期神经胚)到开口时期这一广泛的时空跨度内,Cdx1基因始终调控尾神经管和后肠内胚层的发育形成.Cdx1基因在后肠内胚层的表达区域与Pdx1基因调控的内胚层区域紧密相连,这2种基因的调控区域与脊椎动物的消化内胚层在演化上高度同源.脊椎动物的后肠内胚层主要发育为从小肠到肛门的全部肠道及其附属结构.由此表明,脊椎动物的复杂肠道系统是从简单的后肠器官演化而来的.

图5 Cdx1基因的演化同源性分析

(a) 早期神经胚

(b) T=16 h,生长期神经胚

(c) T=18 h,生长期神经胚

(d) 开口时期神经胚

3 结语

本文通过研究Sox2,Pdx1和Cdx1三种基因在文昌鱼内胚层的发育表达状态,从演化-发育生物学角度阐述了脊椎动物内胚层衍生器官的演化起源基础.Sox2基因的表达状态显示，原索动物的内胚层衍生鳃弓与脊椎动物的神经脊鳃弓在演化上并不具备器官层次的同源性.Pdx1基因的表达状态显示，文昌鱼的盲囊与脊椎动物的胰腺(而非肝脏)同源.Cdx1基因在原索动物内胚层发育过程中的调控作用显示，脊椎动物的复杂肠道系统是从简单的后肠器官演化而来.

References)

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Expression of endodermal kernel regulatory genes during embryonic patterning in amphioxus

He Chunpeng Guan Rui Tian Tian Lu Zuhong

(School of Biological Sciences and Medical Engineering, Southeast University, Nanjing 210096,China) (Steate Key Laboratory of Bioelectronics, Southeast University, Nanjing 210096,China)

The expressions of three kernel vertebrate-endodermal regulatory genes, such asSox2,Pdx1 andCdx1, during amphioxus embryonic patterning are investigated. The results show that compared with vertebrates, the expressing region ofSox2 in amphioxus fore-gut endoderm has a large negative zone which corresponds to the primordium of gill slits, suggesting that the endoderm-derived gill slits in protochordates and the neural-crest-cell-derived pharyngeal gill slits in vertebrates are not evolutionary homologous physiological structures in the organ level. The expressions ofPdx1 in positive fore-mid-gut digestive endoderm of amphioxus, corresponding to the endodermal primordium of diverticulum, are highly homologous with those of the vertebrates, which indicates that the diverticulum in amphioxus is the homologous organ of pancreas. The expressions ofCdx1 of amphioxus are also highly homologous with those of the vertebrates, which reveals that the complicated intestine of the vertebrates is evolved from a simple primitive pioneer.

kernel regulatory gene; body plan; endoderm; amphioxus

2014-11-13. 作者简介: 何春鹏(1980—),男,博士生;陆祖宏(联系人),男,博士,教授,博士生导师, zhlu@seu.edu.cn.

何春鹏，管锐,田田，等.文昌鱼内胚层发育相关核心调控基因的表达[J].东南大学学报:自然科学版,2015,45(1):41-44.

10.3969/j.issn.1001-0505.2015.01.008

Q951

A

1001-0505(2015)01-0041-04