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NTX在兔实验性骨不连早期诊断中的作用

2015-05-05林坚平沈宁江史占军王健肖军吴多能张武

实用骨科杂志 2015年9期
关键词:中段桡骨胶原

林坚平,沈宁江,史占军,王健,肖军,吴多能,张武

(1.海南省人民医院关节外科,海南 海口 570311;2.南方医科大学南方医院关节外科,广东 广州 510515)

实验研究

NTX在兔实验性骨不连早期诊断中的作用

林坚平1,2,沈宁江1,史占军2,王健2,肖军2,吴多能1,张武1

(1.海南省人民医院关节外科,海南 海口 570311;2.南方医科大学南方医院关节外科,广东 广州 510515)

目的 建立骨不连的动物模型,发现实验性骨不连的生化指标变化规律。方法 选取纯种新西兰大白兔分为两组,实验组在前臂桡骨中段截除1.5 cm(包括骨膜),骨断端用骨蜡封闭髓腔,对照组只是在前臂桡骨中段造成骨折,两组分别于术前、术后2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、10周、12周进行X线检查及抽取血样。骨形成特异标志物选择:骨特异性碱性磷酸酶(bone-specific alkaline phosphatase,BSAP)。骨吸收特异标志物包括Ⅰ型胶原氨基端末肽(N-terminal telopeptide of type I collagen,NTX),人抗酒石酸酸性磷酸酶5b(tartrate-resistant acid phosphatase 5b,TRACP 5b)。检测方法采用生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)。结果 实验组第2周3 例有少许骨痂形成,但5周后骨痂情况稳定,术后8周仍无一例愈合。骨折组术后2周开始骨折线模糊,术后6~8周骨痂大量生长。两组间的BSAP、NTX有统计学意义(NTXF值187.512,P<0.001。BSAPF值16.051,P=0.001),BSAP术前、术后两组内各数值无统计学意义,TRACP 5b术前术后、组间、组内各数值无统计学意义。实验组NTX在术后5周开始出现明显下降,术后5周与术前术后各个时间均有统计学意义,术后7周、8周、10周、12周均与术后3周、4周、5周有统计学意义,术后6周以后NTX水平基本稳定。结论 新西兰大白兔骨不连缺损的模型可以选择为前臂桡骨中段,截除1.5 cm(包括骨膜),骨断端用骨蜡封闭髓腔。多个血清生化指标的检测有益于骨折愈合过程的临床评估。术后5周,NTX的显著下降,是否可以早期诊断兔实验性骨不连。

骨不连;生物标志物;人抗酒石酸酸性磷酸酶5b;Ⅰ型胶原氨基端末肽;骨特异性碱性磷酸酶;生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法

骨不连的诊治研究一直是骨科医师长期关注的课题,然而其诊断和随访当前仍主要由传统的X线来完成。这种方法仅仅依赖于临床医师的经验和骨折愈合中骨痂的矿化程度来判断骨折愈合情况,易受投照、冲洗条件及主观因素影响,精确度欠佳,如果骨盐含量变化低于25%,X线就失去了分辨的价值,所以,探索监测骨愈合过程新的可行性方法势在必行。B超、振动响应、机械阻抗分析及人工神经网络对骨的整体机能、力学状态和变化已有广泛的研究,但生物因子监测骨折愈合资料目前在国内外少见报道[1]。为了丰富骨折愈合的诊断标准在分子生物学水平上的具体内容,解决其早期诊断和预测,进一步对促骨生长药物的疗效评定提供客观依据,本研究利用骨代谢异常先于形态学变化、生物标志物测量骨量变化时间远早于骨密度监测技术的基本原理,借助于骨不连时骨转换平衡破坏学说[2],通过骨吸收-形成偶联与胶原代谢、生长因子、血管介导及成骨细胞的关系,选择反映骨转换的特异标志物并检测其在骨折愈合过程中不同时期的浓度,与形态学标准(X线)相比较,动态观察和探讨两者的相关性,希望由此发现某些特定的生物因子是骨折愈合或不愈合的标志物,并建立具有应用价值的数据库。本实验研究建立骨不连的动物(兔)模型,术后X线和生物标志物定期监测,探讨生物标志物在早期诊断骨不愈合的临床价值,发现实验性骨不连的早期生物标志物变化规律。

1 资料与方法

1.1 一般材料 手术器械:刀柄,刀片,蚊式钳,手外科小骨刀,咬骨钳,组织剪,线剪,无菌手术巾单,1号缝合线,手术台,肢体固定用绳索。检测仪器:消毒游标卡尺,X线机。实验用药品:动物用阿莫西林粉剂,1%盐酸利多卡因,络合碘,石灰水。动物喂养:兔笼,兔饲料等。

1.2 实验动物及处理 选取纯种新西兰大白兔20只(5~6个月月龄),体重为2.5~3.0 kg,雌雄各半,随机分为两组,每组10只。实验组在前臂桡骨中段截除1.5 cm(包括骨膜),骨断端用骨蜡封闭髓腔,对照组只是在前臂桡骨中段造成骨折,不行内固定。术后将兔放入笼中,单兔单笼,自由活动。

1.3 手术方法 将实验兔用体积分数3%戊巴比妥钠以20 mg/kg耳缘静脉注射以及氯胺酮以50 mg/kg肌肉注射麻醉。麻醉成功后将兔固定于手术台,均取兔右侧前肢,剪去兔毛,络合碘消毒术区,铺无菌孔巾,取前肢桡骨中段之纵形皮肤切口,长2.5~3 cm。逐层切开后,显露桡骨中段,实验组切除骨膜,以桡骨中段处曲度最大处为标点在桡骨中远段骨干处以锋利小骨刀截取15 mm桡骨干,以游标卡尺量长,长度误差控制在0.1 mm。以小咬骨钳修整断端使其尽量平整,同时尽量使截取部位位于桡骨中远段,骨断端用骨蜡封闭髓腔,对照组只是在前臂桡骨中段造成骨折。两组均不固定骨折部位,1号丝线分别缝合皮肤、皮下,术后络合碘消毒切口皮肤2次/d,术后12 d拆线。术后予口服阿莫西林1周。

1.4 X线和生物标志物检测 两组分别于术前、术后2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、10周、12周进行前臂的放射学检查(摄X线片,观察桡骨缺损区愈合情况)及抽取2 mL血清,存于-80℃。

1.5 检测指标 骨形成特异标志物选择骨特异性碱性磷酸酶(bone-specific alkaline phosphatase,BSAP)。骨吸收特异标志物包括Ⅰ型胶原氨基端末肽(N-terminal telopeptide of type I collagen,NTX),人抗酒石酸酸性磷酸酶5b(tartrate-resistant acid phosphatase 5b,TRACP 5b)。

1.6 检测方法 采用生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA):以检测NTX为例,向预先包埋了NTX单克隆抗体的酶标孔中加入NTX,温育;温育后,加入生物素标记的抗NTX抗体,再与链霉亲和素-HRP结合,形成免疫复合物,再经过温育和洗涤,去除未结合的酶,然后加入底物A、B,产生蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色,颜色的深浅与样品中NTX的浓度呈正相关。

2 结 果

2.1 手术后兔观察结果 20只手术兔切口未见感染,无一例实验兔死亡,全部进入结果分析。

2.2 影像学检查结果 实验组术后第2周3 例有少许骨痂形成,但5周后骨痂情况稳定,术后8周仍无一例愈合。对照组术后2周开始骨折线模糊,术后6~8周骨痂大量生长(见图1~2)。

图1 实验组术后8周未见愈合 图2 对照组术后8周骨痂大量生长

图3 术前至术后12周BSAP血清浓度变化

图4 术前至术后12周NTX血清浓度变化

图5 术前至术后12周TRACP5b血清浓度变化

统计学分析结果:两组间的BSAP、NTX有统计学意义(NTXF值187.512,P<0.001,BSAPF值16.051,P=0.001),BSAP术前术后、两组内各数值无统计学意义,TRACP 5b术前术后、组间、组内各数值无统计学意义。实验组NTX在术后5周开始出现明显下降,术后5周与术前术后各个时间均有统计学意义,术后7周、8周、10周、12周均与术后3周、4周、5周有统计学意义,术后6周以后NTX水平基本稳定。

3 讨 论

近年来,关于骨不连、延迟愈合及其他原因所造成的骨缺损的研究较多,大量研究集中在实验动物上。骨不连模型的试验动物选择基本原则是该实验动物与人类的解剖和生理特点较为接近,通过该动物的实验研究基本能再现人类相关疾病的客观规律,并有较良好的重复性。近年来,有选用较大的动物如猪、马、牛、羊、猴等动物的倾向,但有购置动物成本高、饲养条件高、实验设计难度大的弊端。而体型较小的动物,虽然具有骨骼小、愈合快、适于细胞学研究的优点,但其缺点是不便于骨折固定[3]。研究显示兔的肢体骨与人类较为接近,且有体形小、易驯服、组织修复较快、繁殖周期较短、饲养管理及操作方便、费用便宜、对大样本有利。故本研究选择了新西兰大白兔。

实验动物骨缺损模型是进行组织工程研究的基础,若缺损长度不足够,实验动物骨缺损可自行愈合,则再进行实验组织工程研究已无必要性,只有实验动物骨缺损长度无法自行愈合才能再次进行骨组织工程修复。骨缺损的愈合程度主要决定于缺损的大小,其次是实验动物的月龄、体质量及雌雄等条件考虑在内。新西兰大白兔由于其前肢由尺桡骨组成,取其桡骨中段作骨缺损,同时完整的尺骨起到前肢的支撑作用,无需实行内固定,是较为常用的模型。Johnson等[4]指出完全性骨缺损需要在一些不利于骨生长的环境中进行,如骨缺损超过骨干直径的三四倍(即不能自行修复的长度)、骨局部肌肉覆盖较少、红骨髓含量少的成年动物。国内外关于桡骨缺损模型的长度存在一定的差异。按照Stephen标准,缺损值达到骨直径的1.5~2.0倍即可认为是骨缺损临界值[5],新西兰大白兔桡骨平均直径在4~5 mm,比较多的学者喜欢采用桡骨中段缺损1.5 cm作为缺损模型。Kasten等[6]、Niemeyer等[7]及Geiger等[8]取兔桡骨中段作桡骨远端1.5 cm骨段(包括骨膜)造骨缺损模型,经10周发现骨缺损区为纤维瘢痕组织填充,无骨性连接,骨蜡未吸收,骨端硬化,髓腔封闭,两断端有少量骨痂形成。

本实验通过术后X线检测,证实15 mm长度实验组骨缺损端均为纤维组织连接,骨断端髓腔封闭。实验兔骨折愈合时间一般为6周,12周未愈合视为骨不连。本实验观察时间达术后12周,15 mm长度实验组均未愈合,确定骨不连模型制作成功。

研究骨不连的手段包括骨形态计量学、骨矿盐密度和骨代谢生化指标的测定等,由于骨代谢生化指标具有无创性、可重复检测而成为人们认识和进一步研究骨不连的有力手段。人体骨骼是动态变化的组织,大约每年有10%的骨骼被更新。骨形成、骨吸收和静止3个阶段构成了骨的重建过程;骨转换的过程即是破骨细胞不断清除旧骨,成骨细胞形成类骨质并进行矿化的过程,这两个过程在时间和空间上紧密耦联并发生在同一重建单位中。整个骨吸收-骨重建过程受成骨细胞调控。骨量的多少取决于同一骨重建单位中骨形成与骨吸收的平衡。当这一平衡被破坏,骨吸收大于骨形成时,就导致了骨不连的发生。骨转换过程可以通过生化标志物反映出来,间接显示成骨细胞与破骨细胞的活性。

近些年来研究者更多的采用BSAP、TRACP 5b、NTX等这些敏感性、特异性强的骨代谢生化指标,用于骨丢失率监测、骨折风险程度预测、监测药物治疗反应及代谢性骨病的鉴别诊断中,这些指标是否比骨密度测量更能早期反映骨量变化令人期待。

BSAP是成骨细胞的胞外酶,能排除肝、肾、肠等疾病影响,是反映成骨细胞活性和骨形成的特异及敏感指标,成骨细胞活性增强,则BSAP分泌增加。有些专家进行调查研究发现,BSAP可以作为一种敏感的标志物来测定骨转换率。Southwood等[9]报道兔股骨缺损试验中,术后0~4周血清BSAP减少,在8周达到高峰,然后减少。Moghaddam等[10]在248 例长骨骨折外科治疗病例中,选取萎缩性不愈合15 例对比15 例正常骨愈合。术后1、2、4、8、12、52周生物因子检测。发现:BSAP和Ⅰ型前胶原氨基端前肽(procollagen type Ⅰ N-terminal propeptide,PINP)水平在1周内升高后减少,但在两组绝对值和相对值在愈合过程无明显差异。本试验研究中,实验组BSAP术后升高,第4周达到高峰,第5周时出现下降,第6周以后数值基本稳定。两组的BSAP有统计学意义,但两组内未见显著性差异。和Southwood等[9]、Moghaddam等[10]的结果一样,骨缺损刺激骨的形成,BSAP术后均出现升高现象。动态分析BSAP的变化,对兔实验性骨折愈合过程的监测有一定的帮助。

人抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRACP)和Ⅰ型胶原C端肽(C-terminal telopeptide of type I collagen,CTX)是6种酸性磷酸酶同工酶之一,即第5型,主要由破骨细胞释放,检测血清中TRACP的水平可以反映体内破骨细胞活性和骨吸收状态。正常人血清中会有两种几乎等量的5型TRACP,即5a和5b。5a可以在唾液酸酶作用下转变为5b,纯化的人破骨细胞TRACP是5b。TRACP 5b由于其特异性高、结果不受昼夜变化、饮食、肝、肾疾病的影响,已经成为第二代骨吸收的生化标志物,具有早期监测骨质,降低骨折的风险作用。

Moghaddam等[10]外科治疗病例中,生物因子检测发现:术后在4周和8周,TRACP 5b相对值明显减少,但两组绝对值和相对值在愈合过程无明显差异。本实验研究中,实验组TRACP 5b术后升高,在第4周出现明显峰值,然后下降,基本稳定。实验组和骨折组CTX基本平行,两组间CTX有统计学意义,实验组CTX第5周时出现一个高峰值,但两组内未见明显差异。TRACP 5b和CTX术后均有绝对值的升高,提示着骨缺损后骨吸收会增强,系统性TRACP 5b和CTX变化能反映成功骨折愈合早期进程,有可能可以临床监测愈合过程。

NTX是含有吡啶啉和脱氧吡啶啉的低分子肽,其结构是通过吡啶啉(lysyl pyridinoline,LP)和脱氧吡啶啉(hydroxylysyl pyridinoline,HP)分别连接两条链末端肽,是I型胶原交联末端肽,为总的N端交联物。LP主要存在于骨中,占成熟胶原的21%,HP存在于软骨与骨中,是成熟胶原的主要成份[11-13]。LP和HP在破骨细胞骨吸收过程中,从骨基质中释放出来,以游离氨基酸形式或肽结合形式,即NTX,从尿中排出,是骨降解后尿中出现的一种稳定最终产物。从理论上讲NTX的骨组织特异性很强并与骨吸收密切相关。Garcia-perez等[12]研究发现,NTX用于监测骨吸收变化方面是最敏感的指标。Rosen等[13]研究发现,NTX和骨密度呈负相关。本研究中,实验组NTX在第5周出现明显的降低,从第6周开始出现平稳的NTX水平,与骨折组有明显的差异。

分析两组手术前后骨代谢指标的变化发现,实验组治疗前后,BSAP和TRACP 5b均有波动,虽然组内未见显著性差异,但是至少说明实验组骨转换维持在较高水平,多个血清生化指标的检测有益于骨折愈合过程的临床评估。实验组中NTX术后第5周的下降最明显,有显著性差别,是否可以说明NTX能敏感地反映体内骨转换的状态,能快速随骨吸收被抑制迅速降低。在排除其他干扰因素情况下,术后5周NTX的显著下降,是否可以作为反映骨转换情况、早期诊断兔的骨不连,有待于我们进一步研究。

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Serum N-terminal Telopeptide of Type I Collagen Concentration for Early Diagnosis of Fracture Nonunion in Rabbits

Lin Jianping1,2,Shen Ningjiang1,Shi Zhanjun2,etal

(1.Department of Orthopedic Surgery,People′s Hospital of Hainan Provincial,Haikou 570311,China;2.Department of Orthopedic Surgery,Nanfang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou 510515,China)

Objective Purpose The aim of this study was to establish an experimental animal model of fracture nonunion,and investigate the changes in serum biomarker concentrations in fracture nonunion.Methods Twenty purebred New Zealand rabbits were divided into two groups.In the bone defect group,a 15-mm length of bone (including the periosteum)was removed from the mid-radius,and the medullary cavities were closed with bone wax.In the bone fracture group,the mid-radius was fractured.X-rays were taken and blood samples were collected preoperatively and at 2,3,4,5,6,7,8,10,and 12 weeks after surgery.The serum concentrations of bone-specific alkaline phosphatase (BSAP)as markers of bone formation,and of N-terminal telopeptide of type I collagen (NTX),and tartrate-resistant acid phosphatase 5b (TRACP 5b)as markers of bone resorption,were measured using biotin double-antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay.Results In the bone defect group,bone callus was observed on X-ray at 2 weeks in three rabbits and the bone calluses stabilized at 5 weeks,but none of the bones had healed at 8 weeks.In the bone fracture group,the fracture line was blurry at 2 weeks and bone calluses formed at 6-8 weeks.In the bone defect group,the serum BSAP and TRACP 5b concentrations increased after surgery,peaked at 4 weeks,began to decrease at 5 weeks,and stabilized after 6 weeks.The serum NTX concentration fluctuated during the first 4 weeks,was significantly lower at 5 weeks than at all other time points,and stabilized after 6 weeks.Conclusion These results show that a bone nonunion model can be established in New Zealand rabbits by resecting a 15-mm length of bone from the mid-radius with bone wax blocking.Measurement of the serum BSAP,NTX,and TRACP 5b concentrations may be useful for the early detection of bone nonunion.The serum NTX concentration changed significantly in rabbits with bone nonunion.Further studies are needed to determine the feasibility of using the serum NTX concentration for the early diagnosis of bone nonunion.

nonunion;biomarkers;tartrate-resistant acid phosphatase 5b;N-terminal telopeptide of type I collagen;bone-specific alkaline phosphatase;enzyme-linked immunosorbent assay

1008-5572(2015)09-0812-05

海南省自然科学资金资助课题(808212)

R683

A

2015-04-10

林坚平(1971- ),男,主任医师,海南省人民医院关节外科,570311。

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