韦晓勇 陆波 闵红星 王毅 李军

免疫组化等病理学实验研究中，为避免脑组织细胞的变形及自溶现象，动物处死前需行灌注固定处理[1-2]，故动物在体脑组织的灌注固定效果对试验结果尤为重要。就脑组织灌注固定方面，报道的文献不少，有经心脏灌注、颈总动脉灌注、经股动脉灌注等方法；灌注过程中有夹闭腹主动脉、胸主动脉等；灌注针有用静脉输液器针、自制灌流针（去掉输液器针头的针尖或12-16号针头上套一长约1.5 cm的塑料管并将塑料管前端剪成针尖状）和普通针头等。对此，为寻求一种操作简单易行且灌注固定效果好的方法，笔者在大鼠体脑组织的灌注固定实验过程中，采用动脉留置针夹闭胸主动脉经心脏灌注的方法，现将实验操作过程的体会介绍如下。

1 材料与方法

1.1 试剂和器械 BD动脉留置针（货号：REF682245，规格型号：20 G、1.10 mm× 45 mm、49 mL/min），见图1，4%多聚甲醛新鲜配置（天津市光复精细化工研究所），0.9%复方氯化钠注射液（500 mL/4.5 g、宁夏启元药业），10%水合氯醛（成都金山化学试剂有限公司），三通（舒尔康、批号：120225）、止血钳、组织剪、眼科剪、小动脉夹、皮镊、输液管（2副）等。

图1 BD动脉留置针

1.2 实验动物 选取体重450~500 g，健康雄性18个月龄SD大鼠24只[购于宁夏医科大学动物实验中心，清洁级，合格证号：SCXK（宁）2011-0001]，常规条件下饲养，自由饮水，普通饮食。

1.3 实验方法 将灌注所用的0.9%复方氯化钠注射液加热至37 ℃[3]、新鲜配置4%多聚甲醛滤去杂质[3]、输液管（两副输液管用三通连接好）、手术器械等物品准备就绪后，放置盛有上述0.9%复方氯化钠和4%多聚甲醛的输液瓶距离操作台1.5 m高的位置[4]。雄性SD大鼠经10%水合氯醛（0.4 mL/100 mg）麻醉，待大鼠反正反射消失后，将其仰卧位于实验台上，固定头部和四肢，暴露胸部，沿胸骨中线自剑突向上依次剪开皮肤和胸骨，充分暴露胸腔，显露心脏和主动脉弓，迅速用皮镊提起左侧肺，可见其下位于大鼠脊柱左侧的胸主动脉（ 胸主动脉右侧为食管）[5]，以小动脉夹夹闭胸主动脉。并迅速用眼科剪剪开心包，用动脉留置针在心尖波动最明显处进针，进入约0.5 cm时，右手往外退针芯，同时左手持针翼将套管自左侧心室推送至升主动脉直至套管针尾部，此时，关闭套管针尾端的开关，防止血液外溢，连接输液管，剪破右心耳，打开套管尾端和输液管开关，灌注0.9%复方氯化钠注射液，先快后慢，待自右心耳流出液体颜色清亮，此时旋转三通开关，由快及慢灌注4%多聚甲醛，待大鼠颈部及上肢僵硬，说明灌注固定成功[6]。随后断头取脑，之后将脑组织置于4%多聚甲醛固定4 ℃保存[7]。

1.4 观察指标 （1）观察并记录灌注后大鼠组织的色泽、质感及是否含有血丝。（2）观察并记录实验中所用的0.9%复方氯化钠注射液和4%多聚甲醛的量、灌注插管时间、总灌注时间。灌注插管时间是指从针进入心尖开始至插管成功所用时间，总灌注时间是从针进入心尖开始至灌注固定成功所用时间。（3）观察并记录灌注过程中大鼠颈部、胡须、四肢和尾巴是否抽搐。（4）观察并记录灌注过程中是否发生肺循环灌注。发生肺循环途径灌注的现象时鼻腔中会有灌流液流出[8]。（5）观察并记录在灌注插管过程中损伤血管、穿破心腔和灌注过程中套管脱出等不良事件的发生率。

2 结果

灌注后大鼠脑组织呈乳白色，质地较硬，且未含血丝（图2）。实验中所用的0.9%复方氯化钠注射液和4%多聚甲醛的量分别为（107±9.2）mL、（175±17.3）mL，灌注插管时间和总灌注时间分别为（10±1.8）s、（41±4.1）min。灌注过程中大鼠颈部、胡须、上肢明显抽搐，下肢及尾巴未抽搐。灌注过程中均未发现大鼠鼻腔中有灌流液流出，故未发生肺循环灌注。灌注插管过程中未出现损伤血管、穿破心腔和灌注过程中套管脱出等不良事件。

图2 灌注后大鼠脑组织

3 讨论

免疫组化等病理学实验研究中需对组织进行定性、定位或定量研究。因此，在组织切片之前，需对组织进行灌注固定，因为固定好的组织能抑制细胞内溶酶体酶的释放和活性， 防止自溶；抑制组织中细菌的繁殖，防止组织腐败，使细胞的蛋白质、脂肪、糖等各种成分凝固成不溶性物质，以防止物质扩散，维持原有组织的形态结构[9]。大鼠在体脑灌注过程中，通过大鼠天然的循环系统直接进行灌注固定，固定液可快速、均匀地分布到脑组织各个部位，所以脑组织标本制备多采用此法[10-11]。

灌注固定主要坚持两个原则：一要尽量保持活体的状态；二要尽量行动迅速从而避免动物长时间处于痛苦和濒死状态，引起病理假象，从而干扰科研结果[12]。目前，据文献[12]报道，小动物灌注多采用经心脏灌注方法，而经颈总动脉因操作难度大，费时而逐渐被淘汰。脑组织灌注过程中为节省灌注液，依研究报道有夹闭腹主动脉、胸主动脉等[5]，但夹闭腹主动脉需进行开腹，增加操作难度，延长灌注总时间，降低实验效率。灌注针是保证整个灌注过程的必要条件，因此，灌注针的选择对整个灌注过程尤为重要。有研究报道灌注针可用静脉输液器针[8]、自制灌流针[5，13-14]和普通针头[14]等，这些灌注针虽可进行灌注，但都有各自弊端。如静脉输液器针和普通针头因针尖锋利，在插管过程中可刺破心脏及心室，且易脱出，使灌注失败或发生肺循环灌注。而自制的灌流针[5，13]，一般因针尖钝圆，不易刺入心脏，需借助眼科剪[12]，又因心脏跳动，增加眼科剪的操作难度，在心尖处剪的口可能过大或过小，也可能剪破心脏，影响灌注固定效果，而通过剪口，插入灌注针，动作要轻慢[5]，从而延长灌注时间甚至导致灌注失败。陈浩宇等[14]自制的灌注针因塑料前端成针尖状，在灌注插管时可损伤血管及心腔，并可能引起肺循环灌注。

因此，笔者采用动脉留置针夹闭胸主动脉经心脏灌注的方法，可避免上述弊端，且依据许晓泉等[15]研究，在灌注开始时加热至37 ℃的0.9%复方氯化钠注射液的速度要快，能更好地排出脑组织内的血流，灌注新鲜配置滤去杂质的4%多聚甲醛时速度需放慢，让多聚甲醛在脑组织内停留更长的时间，以便有效固定。本实验结果表明：灌注过程中大鼠颈部、胡须、上肢明显抽搐，下肢及尾巴未抽搐，说明完全夹闭胸主动脉，可节省灌注液；另外，灌注过程中未发生肺循环灌注，保证了体循环灌注的效果，进而灌注后大鼠脑组织呈乳白色，未见血丝，且质地较硬；灌注插管时间仅用了（10±1.8）s，可见操作简单且节约时间；灌注插管过程中未出现损伤血管、穿破心腔和灌注过程中套管针脱出等不良事件，保证了灌注过程顺利进行，且可节约实验成本。

本研究的创新点：采用动脉留置针为灌注针，在整个灌注过程中，发现采用动脉留置针具有以下优势：（1）进针易：动脉留置针芯针尖锋利，心尖处进针容易，进针约0.5 cm时退出针芯，将套管从左心室顺利推送至升主动脉，可节约灌注插管时间；（2）出血少：动脉留置针套管的外径较针芯大[16]，可完全占据心尖穿刺点，减少出血；（3）损伤小：在退出针芯推送套管过程中，由于套管顶端钝圆，可避免损伤心腔及升主动脉；（4）推送顺：动脉留置针套管原料采用聚四氟乙烯，管壁硬度适宜、光滑，可顺利推送至升主动脉；（5）明插管：在动脉套管推送过程中，可看到套管进入升主动脉的全过程，确保插管成功，同时可避免肺循环灌注的发生；（6）易固定：套管尾端两侧有针翼，较其他灌注针容易固定；（7）难脱出：动脉套管长度45 mm，插管成果后，套管很难脱出，有利于灌注的顺利进行；（8）速度可：动脉留置针套管管腔直径1.10 mm，流量49 mL/min，可保证灌注速度，强化灌注效果，节约灌注时间和灌注液。

综上所述，本实验操作简单，灌注插管迅速、损伤小，可避免肺循环灌注，总个灌注过程省时、省液，且灌注固定效果好，值得推广应用。

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