王玉团，时海燕，徐 男，林 晓

(1.山东省食品药品检验研究院，山东 济南 250101;2.山东省千佛山医院，山东 济南 250014;3.国家中医药管理局中药分析重点学科，山东省中医药研究院，山东 济南 250014)

山楂是蔷薇科植物，具有药食两用的特点。作为中药，其具有消食健胃、行气散瘀、化浊降脂之功效。主要用于肉食积滞、胃脘胀满、泻痢腹痛、淤血经闭、产后淤阻、心腹刺痛、胸痹心痛、疝气疼痛、高脂血等症。作为食品，其又广泛应用于食品和保健食品中，既可以增加食品的营养性成分，又可以起到抗氧化的功效，具有广阔的应用前景。

山楂提取物目前仅有企业标准，标准检验项目不够全面，且缺乏专属性，故有必要对其质量标准进行研究。山楂提取物主要含有机酸类、黄酮类两大功效成分，有机酸类物质是消食导滞的主要有效成分，黄酮类物质是防治心血管疾病、降血脂和抗氧化的活性成分，因此选择有机酸、总黄酮为指标成分进行含量测定。为更好地控制山楂提取物的质量，又对提取物进行了薄层色谱鉴别(TLC)及高效液相特征色谱法(HPLC － FP)研究［1～4］。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1200型高效液相色谱仪(美国Agilent公司);Paragon E10xpress箱式电阻炉(美国Paragon公司);DGG－9070B电热鼓风干燥箱(上海森信实验仪器有限公司);岛津UV－2550紫外分光光度计(日本岛津公司);Mettler AE－240型电子分析天平(瑞士梅特勒公司);BK－600C超声波清洗仪(巴克超声设备有限公司)。

1.2 试药及药品 芦丁对照品［中国药品生物制品检定所，批号:100080－200707，紫外分光光度法(UV)含量为92.5%］;山楂对照药材(中国药品生物制品检定所，批号:121138－200905);金丝桃苷(中国药品生物制品检定所，批号:111521－201004);牡荆素鼠李糖苷(中国药品生物制品检定所，批号:111668－200401);硅胶GF254(青岛海洋化工厂分厂，批号:20100808);枸橼酸(中国药品生物制品检定所，批号:100396－200301);所用化学试剂均为分析纯。

山楂提取物样品:山西康立生药业有限公司3批(鲜山楂提取)、陕西瑞康生物工程有限公司1批(干山楂切片提取)、实验室自制样品2批，原料分别是从山西、山东收集到的山楂样品，经徐丽华主任药师鉴定为蔷薇科植物山里红Crataegus pinnatifida Bge.var.major N.E.Br.的成熟果实。样品信息见表1。

表1 山楂提取物样品信息汇总

2 方法与结果

2.1 TLC鉴别

2.1.1 对照药材溶液的制备 取山楂对照药材1.0 g，加水50 mL，加热回流3 h，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加1 mL甲醇溶解，作为对照药材溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 取本品粉末1.0 g，加甲醇10 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加1 mL甲醇溶解，作为供试品溶液。

2.1.3 山楂提取物的TLC鉴别 吸取上述两种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以三氯甲烷 － 甲醇 － 甲酸(10∶1∶0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254 nm)下检视(见图1)。供试品色谱中可见与山楂对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的荧光斑点。

2.2 特征图谱的研究［5，6］经调研，山楂提取物的生产工艺均采用水煎煮法，有机酸类物质是其主要成分，故山楂提取物的特征图谱应以有机酸类物质为主进行建立。

2.2.1 色谱条件与系统适用性 固定相以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Thermo C18，4.6 mm×250 mm，5 μm);以 0.05 mol·L－1磷酸二氢铵(pH 2.5)为流动相;流速为1.0 mL·min－1;检测波长为210 nm，柱温:30℃。理论板数按枸橼酸峰计算应不低于6000。进样量10 μL。

图1 山楂提取物的薄层鉴别图谱(温度:25℃;湿度:55%)

2.2.2 参照品溶液的制备 取枸橼酸对照品适量，精密称定，加水制成每1 mL含10 μg的溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备 取本品0.1 g，精密称定，精密加入水25 mL，超声使溶解，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 精密度 取同一供试品溶液连续进样5次，以枸橼酸峰为参照峰，比较各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果各共有色谱峰的相对保留时间与相对峰面积的RSD均小于0.96%，符合指纹图谱的检测要求。

2.2.5 稳定性 取同一供试品溶液，分别于 0、1、2、4、12 h进样，进行测定，比较各共有峰与参照物峰的相对保留时间和相对峰面积，结果表明各共有指纹相对保留时间和相对峰面积的RSD小于0.92%，符合指纹图谱的检测要求，表明供试品溶液在12 h内基本稳定。

2.2.6 重复性 取山西康立生药业有限公司样品0.1 g(1号样品)，精密称定，共6份，按“2.2.3”项下方法制得供试品溶液，进行测定。结果各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于0.25%，符合指纹图谱的检测要求。

2.2.7 样品测定 取样品1～6号各0.1 g，精密称定，按“2.2.3”项下方法制得供试品溶液，按上述方法进行测定，测得结果见图2和表2。

图2 样品HPLC－FP图谱

表2 样品特征图谱相对保留时间值

根据上述结果，理论板数按S峰(枸橼酸峰)计算应不低于6000，供试品特征图谱应呈现5个特征峰，各色谱峰与S峰的相对保留时间分别为:0.53(峰 1)、0.60(峰2)、0.69(峰 3)、0.76(峰 4)、1.00(峰S)，应在规定值的±5%范围内。

2.3 有机酸的含量测定［7］采用以酚酞为指示剂，酸碱滴定法测定有机酸的含量。

2.3.1 对照品储备液的制备 取枸橼酸对照品适量，加水制成每1 mL含0.8704 mg的溶液，即得。

2.3.2 供试品溶液的制备 取本品0.5 g，精密称定，精密加入水100 mL，超声使溶解，摇匀，过滤，即得。

2.3.3 测定方法 精密量取供试品溶液50 mL，加水150 mL，加酚酞指示液5滴，用氢氧化钠滴定液(0.1 mol·L－1)滴定，即得。每1 mL氢氧化钠滴定液(0.1 mol·L－1)相当于 6.404 mg的枸橼酸(C6H8O7)。

2.3.4 重复性试验 取本品0.5 g，共6份，精密称定，精密加入水100 mL，超声使溶解，摇匀，过滤，即得。照“2.3.3”项下方法测定，计算含量，结果RSD为0.62%。

2.3.5 稳定性试验 取本品0.5 g，按照“2.3.2”制得供试品溶液，分别在 0.5、1、2、3、5 h即得。照“2.3.3”项下方法测定，计算含量，结果 RSD为0.62%。

2.3.6 加样回收试验 取山楂提取物(山西1，批号:01，水分为5.5%，有机酸含量为18.30%)的样品约0.25 g，精密称定，平行6份，分别精密加入对照品储备液50 mL，精密加入水50 mL，超声使溶解，摇匀，滤过，即得供试品溶液。照“2.3.2”项下的方法测定，计算加样回收率，结果见表3。

2.3.7 含量测定 依据“2.3.3”项下测定方法进行，结果见表4。

根据上述6批样品测定结果，暂定本品按干燥品计算，含有机酸以枸橼酸(C6H8O7)计，不得少于15.0%。

2.4 总黄酮含量(UV 法测定)［8～11］

表4 有机酸含量测定结果(n=3)

2.4.1 对照品溶液的制备 取芦丁对照品10 mg，精密称定，置50 mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得(每1 mL中含芦丁0.2 mg)。

2.4.2 供试品溶液的制备 取本品0.25 g，精密称定，精密加入50%甲醇50 mL，超声处理30 min，放冷至室温，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，即得。

2.4.3 测定方法 精密量取供试品溶液6 mL，置25 mL量瓶中，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，混匀，放置6 min，再加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加氢氧化钠试液10 mL，再加50%甲醇至刻度，摇匀，放置15 min，以相应试剂为空白，照紫外－可见分光光度法，在500 nm的波长处测定吸光度。

2.4.4 线性关系考察 精密称取芦丁对照品13.88 mg，置50 mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取 1、2、3、4、5、6 mL，分别置25 mL量瓶中，各加50%甲醇至6 mL，照“2.4.3”项下方法，测定吸光度，以吸光度为纵坐标(Y)，对照品溶液浓度为横坐标(X)，绘制标准曲线。结果芦丁在浓度为0.01027～0.06163 mg·mL－1范围内，线性关系良好，回归方程为:Y=12.221X+0.01(r=0.9997)。

2.4.5 重复性试验 取山楂提取物(山西1，批号:01)样品0.25 g，精密称重，共6份，分别置50 mL量瓶中，照“2.4.3”项下方法测定，计算含量，RSD为1.27%。

2.4.6 加样回收试验 取山楂提取物(山西1，批号:01，水分为5.5%，总黄酮含量为11.80%)的样品约0.12 g，精密称定，平行6份，分别精密加入对照品储备液25 mL(芦丁浓度为0.5380 mg·mL－1)，精密加入50%甲醇25 mL，超声处理，放冷至室温，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得供试品溶液。照“2.6.3”项下的方法测定，计算加样回收率，结果见表5。

表5 加样回收试验结果

2.4.7 样品的测定 精密称取本品0.25 g，照“2.4.2”项方法制备供试品溶液，照“2.4.3”项下方法测定，计算含量，结果表6。

表6 含量测定结果

根据上述6批样品测定结果，暂定本品按干燥品计算，含总黄酮以芦丁(C27H30O16)计，不得少于8.0%。

3 讨论

3.1 因该提取物生产的季节性很强，且储藏条件要求较高，故各生产企业很少留样，导致收集的批次受限，为保证所建立的特征图谱的科学性，仍需进一步收集样品，继续该项研究。

3.2 在特征图谱的研究过程中，曾尝试用甲醇－0.1%磷酸(5∶95)、0.05 mol·L－1磷酸二氢铵、0.05 mol·L－1磷酸二氢铵(pH=2.5)等多种流动相进行试验，结果甲醇－0.3%磷酸(5∶95)为流动相色谱峰保留时间较小，不利于色谱峰的分离比较;用0.05 mol·L－1磷酸二氢铵为流动相，枸橼酸色谱峰有拖尾现象;用0.05 mol·L－1磷酸二氢铵(pH=2.5)为流动相分离效果较好，保留时间较合适，且流动相为缓冲盐，便于控制流动相的pH范围，有利于提高有机酸类物质色谱分离的重现性。

3.3 试验中曾采用HPLC法测定山楂提取物中金丝桃苷和牡荆素鼠李糖苷含量［12］，结果金丝桃苷含量在0～0.13%范围内，牡荆素鼠李糖苷含量在0.03%～0.10%范围内，各批次间差异非常明显，且含量较低，故暂不列入标准正文。

［1］刘荣华，邵峰，邓雅琼，等.山楂化学成分研究进展［J］.中药材，2008，31(7):1100 －1103.

［2］乔晓莉，吴士杰，祁向争，等.山楂中化学成分的UPLC/ESI－TOF/MS分析［J］.现代药物与临床，2014，29(2):120－124.

［3］楼陆军，罗洁霞，高云.山楂的化学成分和药理作用研究概述［J］.中国药业，2014，23(3):92 －94.

［4］吴艳苹.建议《中国药典》增加山楂中山楂核限量范围检查项［J］.首都医药，2014，21(10):14.

［5］罗文，刘斌，王伟，等.山楂药材HPLC指纹图谱研究［J］.现代药物与临床，2009，24(1):39 －42.

［6］王领弟，李艳荣，张晓峰，等.山楂叶指纹图谱研究［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17(19):74 －78.

［7］雷成康，郭玲.山楂中有机酸含量测定方法的改进［J］.中药材，2010，33(5):745 －747.

［8］张文莉，高敏，石森林.分光光度法测定山楂叶提取物中总黄酮的含量［J］.中华中医药学刊，2011，29(5):1148－1151.

［9］李宏伟，张守勤，窦建鹏，等.不同生长期山楂叶中黄酮类化合物的含量测定［J］.时珍国医国药，2007，18(4):773－774.

［10］牛明娟，惠秋沙.泽漆总黄酮的提取与含量测定［J］.药学研究，2013，32(3):131 －133.

［11］尚金燕，历娜，杨雪.肾叶打碗花总黄酮含量的分析［J］.药学研究，2014，33(6):326 －327.

［12］王鑫波，高敏，童丽姣，等.山楂叶提取物中牡荆素鼠李糖苷的含量测定［J］.中华中医药学刊，2010，28(10):2098－2010.