邹佳峰,吴 瑶

(1.浙江中医药大学,浙江 杭州 310053；2.浙江中医药大学中药饮片有限公司,浙江 杭州 311401)



正交试验优选盐酸水解提取荷叶总黄酮醇苷工艺

邹佳峰1,吴 瑶2

(1.浙江中医药大学,浙江 杭州 310053；2.浙江中医药大学中药饮片有限公司,浙江 杭州 311401)

目的：利用甲醇-盐酸水解法从荷叶中提取总黄酮醇苷。方法：利用正交实验优选总黄酮醇苷最佳提取工艺，考察盐酸浓度、水解时间及水解温度对总黄酮醇苷得率的影响。结果：总黄酮醇苷最佳提取工艺为：10%盐酸甲醇溶液在80℃条件下水解120min，总黄酮醇苷含量为32.53mg/g。结论：甲醇-盐酸水解法可用于荷叶中总黄酮的提取，其中水解温度对总黄酮醇苷的提取影响较大。

总黄酮醇苷；荷叶；正交试验；提取工艺

荷叶系睡莲科莲属植物莲NelumbonuciferaGaertn.的干燥叶[1]。传统医学认为荷叶性味苦寒，具有清暑利湿、生发清阳、清心去热、止血利水的功效[1]，研究表明荷叶具有抗氧化[2]、降血脂[3]、抑菌[4,5]、抗病毒等作用。总黄酮醇苷作为一类重要活性物质具有抑制血小板活化因子[6]、改善人体心脑血液循环[7]、增强肌体免疫功能[8]、清除氧自由基、抗病毒[8]等作用。此前，对银杏叶总黄酮醇苷有较多的研究，且开发出了一系列相关产品，但对荷叶总黄酮醇苷及其相关产品研究较少。

鉴于此，在前期水提盐酸水解和醇提[9]的基础上，以盐酸甲醇为溶剂，设计正交试验对盐酸浓度、水解时间及水解温度进行优化筛选，获取最佳提取工艺。

本文参考有关文献资料[1,11]，采用以槲皮素、山柰素、异鼠李素为对照，计算总黄酮醇苷的含量，公式为：总黄酮醇苷含量=(槲皮素含量+山柰素含量+异鼠李素含量)×2.51。

1 仪器和试药

1.1 仪器

Ultimate3 000型高效液相色谱仪(美国戴安公司)；Agilent Eclipse XDB-C18(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱，R-201恒温水浴锅(上海申生科技有限公司)；BP210S十万分之一电子天平(Sartorius公司)；真空干燥箱DZF-6021型(上海精宏实验设备有限公司)。

1.2 试药

荷叶(批号：HY-20140419)，产地湖北，购于浙江中医药大学中药饮片有限公司；槲皮素(批号：100081-200907，含量96.5%)、山柰素(批号：110861-201209，93.2%)、异鼠李素(批号：110860-200407)购自中国食品药品检定研究院；甲醇为色谱纯，水为重蒸水。

2 方法和结果

2.1 色谱条件

以Agilent Eclipse XDB-C18(4.6mm×250mm,5μm)为色谱柱，甲醇-0.4%磷酸溶液(50∶50)为流动相，检测波长为360nm，流速为1.0mL/min，柱温为25℃，该条件下，样品中各待测组分与其相邻色谱峰得到基线分离[10,11]，见图1。

图1 总黄酮醇苷类成分槲皮素、山柰素和异鼠李素标准品及荷叶样品色谱

2.2 标准品溶液制备

分别精密称取标准品槲皮素3.78mg、山柰素2.84mg、异鼠李素3.12mg于10mL容量瓶中，加甲醇10mL溶解，摇匀制成储备液。精密吸取标准品槲皮素、山柰素、异鼠李素储备液依次稀释成各浓度的对照品溶液：槲皮素14.59、29.18、58.36、116.72、233.44μg/mL；山柰素10.59、21.18、42.36、84.72、169.44μg/mL；异鼠李素12.48、24.96、49.92、99.84、199.68μg/mL，待测。

2.3 供试品溶液制备

称取荷叶粉末约0.1g，加入10%盐酸甲醇溶液20mL，在80℃条件下水解120min。过滤，取续滤液，即得供试品溶液。

2.4 精密度考察

精密吸取槲皮素58.36μg/mL、山柰素42.36μg/mL、异鼠李素49.92μg/mL的对照品溶液，重复测定6次，槲皮素、山柰素和异鼠李素峰面积的RSD分别为0.486%、0.372%和0.738%，表明仪器精密度良好。

2.5 线性关系考察

精密吸取“2.2”项下稀释的标准品溶液，在“2.1”色谱条件下进行分析，以对照品进样量(μg/mL)为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，得回归方程：槲皮素Y=0.468 9X+0.333 3，r=0.999 8；山柰素Y=0.458 2X+0.125 0，r=0.999 9；异鼠李素Y=0.487 7X-1.045 8,r=0.999 8，表明对照品槲皮素在14.59～233.44μg/mL、山柰素在10.59～169.44μg/mL、异鼠李素在12.48～199.68μg/mL范围内呈良好线性关系。

2.6 准确度考察

称取同一批次荷叶粉6份，每份约0.1g，加入槲皮素0.365mg/g 2mL、山柰素21.18μg/mL 1mL、异鼠李素49.92μg/mL 1mL，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，并进样分析。计算槲皮素、山柰素和异鼠李素的加样回收率分别为99.79%(RSD=1.79%)、98.82%(RSD=2.14%)和98.38%(RSD=2.46%)，表明该方法准确度良好。

2.7 稳定性考察

取供试品溶液，分别放置0、6、12、18、24h后进样测定，计算得槲皮素、山柰素和异鼠李素峰面积的RSD分别为0.792%、1.537%和1.328%，表明供试品溶液在24h内稳定。

2.8 单因素试验

2.8.1 盐酸浓度考察 以盐酸甲醇为提取溶剂，称取荷叶粉末约0.1g，加入20mL溶剂，其中盐酸浓度分别为2%、4%、6%、8%、10%、12%，在80℃条件下水解90min。槲皮素、山柰素、异鼠李素及总黄酮醇苷含量见表1。

表1 盐酸浓度对黄酮类成分提取的影响

2.8.2 水解时间考察 以盐酸甲醇为提取溶剂，称取荷叶粉末约0.1g，加入20mL溶剂，其中盐酸浓度为8%，在80℃条件下分别水解15、30、60、90、120、150min。槲皮素、山柰素、异鼠李素及总黄酮醇苷含量见表2。

2.8.3 水解温度考察 以盐酸甲醇为提取溶剂，称取荷叶粉末约0.1g，加入20mL溶剂，其中盐酸浓度为8%，分别在50、60、70、80、90、100℃下水解90min。槲皮素、山柰素、异鼠李素及总黄酮醇苷含量见表3。

由上述单因素实验结果可知，在不同盐酸浓度、水解时间和水解温度下，荷叶总黄酮醇苷得率有明显的差异，且黄酮类成分槲皮素、山柰素、异鼠李素在不同条件下有相应的差异。故试验筛选3个因素各3个水平，以总黄酮醇苷为评价指标对提取工艺进行正交优化。

表2 水解时间对黄酮类成分提取的影响

表3 水解温度对黄酮类成分提取的影响

2.9 正交试验

2.9.1 试验因素与水平 在上述盐酸浓度、水解时间和水解温度单因素试验的基础上，设置 L9(34)正交试验，其中影响因素和水平见表4。

表4 影响因素和水平

2.9.2 正交试验结果与分析 由试验结果表5和方差分析表6可看出，三种因素及其水平对总黄酮醇苷提取量的影响是不同的：正交试验结果显示，各因素作用主次为C>A>B；方差分析结果表明，因素A和C均具有显著性差异，而水解温度C较于盐酸浓度A对荷叶的总黄酮醇苷的提取有更大的影响。故试验以A2B2C2组合为佳，即以盐酸甲醇为提取溶剂，盐酸浓度为10%在80℃条件下水解120min为最佳提取工艺。

表5 正交试验结果

表6 方差分析

2.10 样品分析

取相同批次荷叶样品，精密称取粉末约0.1g，共5份，用上述最佳条件进行提取和测定，分析结果见表7。

表7 荷叶总黄酮醇苷含量测定

3 讨论

荷叶的活性成分是以荷叶碱为主的生物碱类化合物，已有较多的研究。总黄酮醇苷作为一类重要的黄酮类化合物，在荷叶中占有相当大的比重。近些年来，关于银杏总黄酮醇苷的研究报道较多，并开发出了如银曲胶囊、心脑舒通等医疗保健品。我国荷叶资源丰富，而相应的医疗保健产品开发甚少。鉴于此，本试验设计正交试验，对荷叶总黄酮醇苷的提取工艺进行研究，以获取简便、可行、高效的提取方法。

通过正交试验结果及方差分析可知，水解温度在荷叶总黄酮醇苷水解提取过程中影响最为显著，盐酸浓度次之。结合验证与比较试验，确定最佳工艺为A2B2C2，即以盐酸甲醇为提取溶剂，盐酸浓度为10%在80℃条件下水解120min。

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[10] 李彦博,孙静,孙弥.银杏叶中总黄酮醇苷的含量测定[J].中国实用医药,2008,3(6):16-17.

(责任编辑：魏 晓)

Optimization of Hydrochloric Acid Hydrolysis Extracting Total Flavonoid Glycoside from Lotus Leafs by Orthogonal Test

Zou Jiafeng1,Wu Yao2

(1.Zhejiang Chinese medical University,Hangzhou 310053，China;2.Zhejiang Chinese medical University mecical pieces,.LTD,Hangzhou 311401，China)

Objective:To optimize the extraction process of Total Flavonoid Glycoside from Lotus Leafs.Methods:The Total Flavonoid Glycoside was extracted using hydrochloric acid hydrolysis,and the extract rate of Total Flavonoid Glycoside was studied by hydrochloric acid concentration of extraction,the hydrolysis of time of extraction,the hydrolysis of temperature of extraction.Results:The optimum extracting technology were as follows:with hydrochloric acid concentration is 10%,time of extracting is 120 min,temperature of extracting is 80℃.The extract rate of Total Flavonoid Glycoside is 32.53mg/g.Conclusion:The method of hydrochloric acid hydrolysis were uesed extracting Total Flavonoid Glycoside is possibly,and the significantly factor is extract temperature.

Total Flavonoid Glycoside; Lotus Leafs; Orthogonal Test Design； Extracting Technology

2015-03-03

邹佳峰(1994-)，男，浙江中医药大学在读生，研究方向为中药学。

R284

A

1673-2197(2015)13-0019-03

10.11954/ytctyy.201513008