刘 敬，王 琼，谢彩玲，谢文琼，赵 斌*

(1.中山火炬职业技术学院 生物医药系，广东 中山 528436；2.国家中药现代化工程技术研究中心中山健康产品分中心，广东 中山 528436)



参七黄抗结肠癌细胞株SW620作用筛选研究

刘 敬1,2，王 琼1，谢彩玲1，谢文琼1，赵 斌1*

(1.中山火炬职业技术学院 生物医药系，广东 中山 528436；2.国家中药现代化工程技术研究中心中山健康产品分中心，广东 中山 528436)

目的：对参七黄中的苦参碱等9种组分进行抗结肠癌活性的体外初步筛选。方法：应用MTT法测定各组分对SW620细胞株增殖活性的影响，检测其抑制SW620的剂量效应关系；应用光学显微镜、荧光显微镜进行细胞形态学观察。结果：芦荟大黄素、大黄素、大黄酸、人参皂苷Rh2、槐定碱、苦参碱各浓度均显示出抑制SW620结肠癌细胞增殖的作用，且量效关系明显。结论：此6个单体成分可组成新配伍进行抗癌活性研究，为研发中药治疗结肠癌的靶向新药提供实验依据。

参七黄；结肠癌；SW620；组分筛选

近年来，随着人们生活水平的提高和生活习惯的改变，结肠癌在我国发病率呈不断上升趋势，在消化道肿瘤中位居第二。中医药对结肠癌病因病机具有独特的认识，并对结肠癌的治疗取得了一定成果，发挥着越来越大的作用。参七黄是由苦参、三七、大黄等组成的中药复方制剂，其针对结肠癌患者结肠局部的关键病机“毒”与“瘀”，以清热燥湿、泻火解毒、活血化瘀为治法，从根本上去除导致结肠癌之病理因素，改善结肠癌变组织的病理生理环境，发挥抗癌、预防复发、转移、控制并发症的独特疗效。本研究在现有文献研究报道[1-4]基础上，对参七黄中主要活性单体进行抗结肠癌活性的体外筛选研究，为其组分配伍的抗肿瘤活性研究提供实验基础。

1 材料与仪器

1.1 药品与试剂

苦参碱(XC071201)、氧化苦参碱(XC071212)购自西安小草生物技术有限公司；槐定碱(MUST-11060901)、大黄素(MUST-11042601)、大黄酸(MUST-11032801)、芦荟大黄素(MUST-10112301)、三七皂苷R1(MUST-10092301)、人参皂苷Rh2(MUST-09071501)、人参皂苷Rg1(MUST-11041201)购自成都曼思特生物科技有限公司，均用培养基溶解成不同浓度备用。DMEM高糖培养基(Hyclon公司)、胰蛋白酶(购自GIBCO公司)，MTT、谷氨酸(均购自Sigma公司)，胎牛血清(PAA)，HEPES(Amresco 分装)，其余均为国产分析纯。

1.2 仪器

倒置相差显微镜(Olympus IX70，Japan)，CO2孵箱(Thermo 3111)，超净工作台(SW-CJ-2FD，苏州净化公司，中国)，超纯水仪(Millipore)，酶标仪(Multiskan MK3)，LDZ5-2 型低速自动平衡离心机(北京医用离心机厂)。

1.3 细胞株

结肠腺癌细胞株SW620(购自中国科学院细胞库)。

2 方法

2.1 细胞接种培养

从液氮罐中取出细胞株，迅速置于37℃的水浴缸中解冻，用吸管吸净管中细胞悬浮液，转移至10mL离心管中。1 000r·min-1离心5min，弃上清液，加入约4mL生理盐水，吹打混匀，1 000r·min-1离心5min，弃上清液，再加入2mL含胎牛血清10% RPMI 1640培养液或DMEM培养液，吹打混匀后置入细胞培养瓶中，放入37℃、5%CO2孵箱中培养。

2.2 MTT法测定各成分肿瘤抑制率[5]

取对数生长期细胞，消化后用吸管吹打使之分散均匀制成单细胞悬液，按每1mL含1×105个细胞，每孔100μL接种于96孔培养板中，培养24h后，分别加入相同体积的受试药液，同时加入适量完全培养液(900mL·L-1DMEM培养基，100mL·L-1胎牛血清，青霉素1×105U·L-1，链霉素1×105U·L-1)补足，使每孔200μL终体积(每组6个复孔)，同时设空白对照组，继续培养。待药物作用20h后，加入MTT液继续培养4h，吸取上清液，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150μL，充分振荡，室温静置10min，用酶标仪于492nm波长处测定吸收值，并计算细胞生长抑制率(%)=(1-用药组平均OD值/对照组平均OD值)×100%。期间每天于倒置显微镜下观察细胞生长情况。

2.3 统计学方法

3 结果

3.1 形态学观察

显微镜下可见细胞培养约2h开始贴壁，贴壁后的细胞呈圆形。12～24h细胞开始伸出长短不等的细小突起，细胞多呈梭形(图1A、1B)，48h后对照组梭形细胞明显，细胞数明显增加(图1C)，给药组细胞生长状态变差，且细胞数目增加不明显(图1D)，MTT作用4h后，可见给药组细胞形成结晶数较对照组明显减少(图1E、图1F)。

3.2 各组分对细胞体外存活的影响

测定参七黄复方中芦荟大黄素等9种单体组分对体外培养的细胞吸收值(其大小能反映活细胞数量)的影响，并按公式计算细胞生长抑制率，统计结果见表1至表7。

表1 苦参碱对SW620结肠癌细胞存活的影响

组别药品浓度(mg·mL-1)吸收值抑制率(%)空白对照-0.905±0.09802.50.598±0.037**33.8苦参碱20.686±0.055**24.11.50.716±0.043**20.810.761±0.023**15.7

注：与空白对照组比较*P<0.05，**P<0.01。

图1 细胞形态学观察

组别药品浓度(mg·mL-1)吸收值抑制率(%)空白对照--0.905±0.098050.702±0.032**22.4氧化苦参碱40.723±0.070**20.130.741±0.023**18.020.738±0.040**18.3

注：与空白对照组比较*P<0.05，**P<0.01。

表3 槐定碱对SW620结肠癌细胞存活的影响

组别药品浓度(mg·mL-1)吸收值抑制率(%)空白对照--0.801±0.038020.293±0.035**63.4槐定碱10.544±0.048**31.90.50.706±0.041**11.60.250.797±0.0400.4

注：与空白对照组比较*P<0.05，**P<0.01。

表4 人参皂苷Rg1、Rh2对SW620结肠癌细胞存活的影响

组别药品浓度(μg·mL-1)吸收值抑制率(%)空白对照--0.799±0.02801000.503±0.056**37.1人参皂苷Rh2500.562±0.036**29.7250.599±0.047**25.112.50.611±0.019**23.61000.611±0.033**23.7人参皂苷Rg1500.619±0.038**22.6250.593±0.019**25.812.50.595±0.030**25.6

注：与空白对照组比较*P<0.05，**P<0.01。

4 讨论

参七黄复方单体成分中芦荟大黄素、大黄素、大黄酸、人参皂苷Rh2、槐定碱、苦参碱各浓度均显示出抑制SW620结肠癌细胞增殖的作用，且随浓度增加，抑制癌细胞增殖作用增强，量效关系明显。

目前临床能用于治疗结肠癌的中药制剂不多，《新编国家中成药》所载5 017种制剂中仅有艾迪注射液、复方斑蝥胶囊、抗癌平丸、消癌平片及糖浆、柘木糖浆等几种中成药有治疗结肠癌的效果，且存在以下共性问题：①药物均为水、醇粗提物或药材粉末，制剂水平低，质量可控性、稳定性差；②采用静滴注或口服，药物不能靶向作用于癌组织，全身或消化道不良反应明显；③广泛用于治疗肺癌、肝癌、淋巴癌等，缺乏针对性地治疗结肠癌。本实验结果提示参七黄复方中6个单体成分可以组成配伍新方，深入进行抗结肠癌活性及机理研究，为进一步开发针对结肠癌细胞靶向给药的现代中药新制剂提供科学依据。

小儿清肺八味散等为《卫生部药品标准》 蒙药分册[2]品种，系蒙药中最具有代表性的常用药品；为了保证以上8种蒙药制剂的质量，按照《中国药典》2010年版一部微生物限度检查法的相关规定[1]，对8种蒙药制剂品种建立了微生物限度检查方法并加以验证。该法简便易行、准确可靠，能够科学有效地控制以上8种蒙药制剂的质量，并可为更好地评价蒙药制剂的微生物限度检查法提供科学的实验依据。

[1] 杨宾,付强,王亚娟,等.芦荟大黄素对人结肠癌细胞SW480增殖周期及凋亡的影响[J].山西中医,2008,24(6):48-50.

[2] 梁磊,张绪慧,王晓燕,等.槐定碱对人结肠腺癌细胞株SW620增殖和凋亡的影响[J].中国药理学通报,2008,24(6):782-787.

[3] 邹健,冉志华,许琦,等.氧化苦参碱对人结肠癌细胞株SW1116杀伤作用的实验研究[J].中华消化杂志,2005,25(4):207-211.

[4] 梁磊,王晓燕,张绪慧,等.苦豆子生物碱抗结肠腺癌细胞株SW620的作用筛选[J].中药材,2008,31(6):866-869.

[5] 魏伟,吴希美,李元建.药理实验方法学[M].第2版.北京:人民卫生出版社,2010:1568.

(责任编辑：尹晨茹)

Study on Constituents from Shenqihuang against Adenocarcinoma of Colon Cell Line SW620 in vitro

Liu Jing1,2, Wang Qiong1, Xie Cailing1, Xie Wenqiong1, Zhao Bin1*

(1.Department of Biomedicine, Zhongshan Torch Polytechnic, Zhongshan 528436, China; 2.Zhongshan Health Products Center, National Engineering Research Center for Modernization of Traditional Chinese Medicine, Zhongshan 528436, China)

Objective:To study constituents from shenqihuang against adenocarcinoma of colon cell line SW620.Methods:SW620 cell line was treated with Constituents from shenqihuang at various concentrations，The effect on cell Proliferative activity was measured by MTT assay and the effects of alkaloids against cell growth were compared. The changes of cell morphology were observed through optical microscope and fluorescence microscope.Results:Aloe emodin, emodin, rhein, ginsenoside Rh2, Sophoridine matrine were identified to produce growth inhibition against SW620 cells.Conclusion:The 6 constituents from shenqihuang can form a new compatibility. The results of this study provide experimental evidence for targeting new drug research and development of traditional Chinese medicine treatment for colon cancer.

Alkaloid; Sophora Alopecuraides L1; Colorectal Carcinoma; SW620

2015-03-03

中山市科技计划项目(中科发[2010]122号)

刘敬，女，博士，中山火炬职业技术学院讲师，研究方向为中药药效及作用机理。

R285.5

A

1673-2197(2015)12-0012-02

10.11954/ytctyy.201512005