张 鹤,马 宁

(1.辽阳市食品药品检验所，辽宁 辽阳 111000；2.抚顺市中医院，辽宁 抚顺 113008)



HPLC法测定乳癖消结丸中丹参酮ⅡA、橙皮苷含量

张 鹤1,马 宁2

(1.辽阳市食品药品检验所，辽宁 辽阳 111000；2.抚顺市中医院，辽宁 抚顺 113008)

目的：建立乳癖消结丸中丹参酮ⅡA、橙皮苷高效液相含量测定方法。方法：色谱柱为Diamonsil C18(200mm×4.6mm，5μm)，丹参酮ⅡA流动相：甲醇-水(75∶25)，检测波长：270nm，流速：1mL/min，柱温：30℃；橙皮苷流动相为乙腈-0.2%磷酸溶液(21∶79)，检测波长：284nm，流速：1mL/min，柱温：25℃。结果：丹参酮ⅡA进样量在0.040 3～0.403 2μg范围内与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为：Y=3E+06X-38 932(r=0.999 7)，平均回收率为96.4%，RSD为1.6%(n=6)；橙皮苷进样量在0.115 7～0.694 2μg范围内与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为：Y=787 926X-3 384.3(r=0.999 9)，平均回收率为96.9%，RSD为0.9%(n=6)。结论：该方法可用于测定乳癖消结丸中丹参酮ⅡA及橙皮苷的含量，简便稳定、灵敏度高、重现性好，可作为有效控制该药物质量的参考指标。

乳癖消结丸；丹参酮ⅡA；橙皮苷；HPLC

乳癖消结丸为抚顺市中医院制剂，已用于临床多年，疗效确切，具有软坚散结、行气止痛的功效，主要用于治疗肝郁痰凝所致的乳腺内肿块、乳增生、乳癖、乳癌等症。该药物由丹参、青皮、牡蛎、鳖甲、穿山甲、川楝子、红花、青皮、延胡索、通草等十二味中药粉碎加炼蜜制成。目前，乳癖消结丸质量标准中仅有对丹参酮ⅡA及橙皮苷的TLC定性鉴别，且无含量测定标准，因此不能准确有效控制药品的质量。方中丹参活血调经、祛瘀止痛，青皮对于消除乳肿、乳核具有独特功效。本文对方中主药丹参及青皮中有效成分丹参酮ⅡA及橙皮苷有效成分进行含量测定[1-7]，探讨更加准确、有效的药品质量控制方法，以保证药品质量稳定性，现具体报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪LC-2010(日本岛津公司)，LC-10AT vp输液泵；HS-3120型超声波清洗器，赛多利斯电子天平BP211-D。

1.2 试剂与试药

乳癖消结丸(辽阳市中医院制剂室，批号：20140306、20140521、20140615)；丹参酮ⅡA对照品(批号：110766-200619，中国食品药品检定研究院)，橙皮苷对照品(批号：110721-201316，含量95.3%，中国食品药品检定研究院)。甲醇、乙腈为色谱纯，水为二次蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 丹参酮ⅡA含量测定

2.1.1 色谱条件 色谱柱为DiamonsilC18(200mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇-水(75∶25)；检测波长：270nm；流速：1mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL；理论塔板数按丹参酮ⅡA峰计算应不低于2 000。

2.1.2 溶液配制 ①对照品溶液制备。精密称取丹参酮ⅡA对照品适量，加甲醇制成0.2mg/mL的对照品储备液；精密量取对照品储备液2mL加甲醇定容至25mL容量瓶，制得16μg/mL的对照品溶液。

②供试品溶液制备。取本品适量，研细，精密称取1.0g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称重，冷浸2h，超声处理30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

③阴性对照溶液制备。取除丹参外的其他各味药材，按处方比例，粉碎，加炼蜜制成阴性对照样品，再按供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液。

2.1.3 系统适应性试验 对照品溶液、供试品溶液、阴性空白溶液各10μL，注入高效液相色谱仪测定。在上述色谱条件下，丹参酮ⅡA峰与其它色谱峰达到基线分离，阴性空白溶液无干扰。见图1。

2.1.4 线性范围考察 精密吸取“2.1.2”项对照品储备液0.5、1、2、3、4、5mL置于25mL棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，分别制成4、8、16、24、32、40μg/mL的对照品溶液，各进样10μL。按上述色谱条件测定，记录色谱峰面积，以进样量(μg)为横坐标(X)，色谱峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，结果表明进样量在0.040 3～0.403 2μg范围内线性关系良好，回归方程为：Y=3E+06X-38 932，r=0.999 7。

2.1.5 精密度试验考察 精密吸取对照品溶液10μL，注入液相色谱仪，连续进样6次，测定样品中丹参酮ⅡA色谱峰面积。测定结果RSD为0.92%，表明仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性试验考察 精密吸取同一份供试品溶液，分别于配置后0、2、4、8、16、24h进样10μL，按“2.1.1”项色谱条件，测定样品中丹参酮ⅡA色谱峰面积。结果显示，RSD为0.87%，表明供试品溶液制备24h内稳定性良好。

2.1.7 重复性试验考察 取同一批次乳癖消结丸样品(批号：20140306)6份，按供试品溶液制备方法提取、制备，测定丹参酮ⅡA平均含量为0.42mg/g，RSD为1.0%。测定结果提示，该实验重复性良好。

2.1.8 加样回收率试验考察 取已知含量同一批号样品(批号：20140306)6份，每份约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，再分别精密加入0.224 0mg/mL(精密称取丹参酮ⅡA对照品11.20mg，加甲醇定容至50mL容量瓶)的丹参酮ⅡA对照品1mL，按“2.1.2”项方法配制供试品溶液，按“2.1.1”项色谱条件测定丹参酮ⅡA含量，计算回收率。结果显示，平均回收率为96.4%，RSD为1.6%(n=6)。见表1。

图1 丹参酮ⅡA HPLC色谱

2.1.9 样品测定 取3个不同批次样品，按供试品制备方法制备供试品溶液，按上述色谱条件，注入液相色谱仪，测定色谱峰面积。结果见表2。

2.2 橙皮苷含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱为Diamonsil C18(200mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈-0.2%磷酸溶液(21∶79)；检测波长：284nm；流速：1mL/min；柱温：25℃；进样量：10μL；理论塔板数按橙皮苷峰计算应不低于2 000。

2.2.2 溶液的配制 ①对照品溶液制备。精密称取橙皮苷对照品适量，加甲醇制成0.2mg/mL的对照品储备液；精密量取对照品储备液2mL加甲醇定容至25mL容量瓶中，制得40μg/mL对照品溶液。

②供试品溶液制备。取本品适量，研细，精密称取0.2g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，称重，冷浸2h，超声处理1h，放冷，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

表1 丹参酮ⅡA加样回收率试验测定结果 (n=6)

表2 丹参酮ⅡA含量测定结果 (n=3，mg·g-1)

③阴性对照溶液制备。取除青皮外其他各味药材，按处方比例，粉碎加炼蜜制成阴性对照样品，按上述供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。

2.2.3 系统适应性试验 对照品溶液、供试品溶液、阴性空白溶液各10μL，注入高效液相色谱仪测定。在上述色谱条件下，橙皮苷峰与其他色谱峰达到基线分离，阴性空白溶液无干扰。见图2。

图2 橙皮苷 HPLC色谱

2.2.4 线性范围考察 精密吸取“2.2.2”项对照品储备液0.5、1、1.5、2、2.5、3mL置于10mL棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，分别制成10、20、30、40、50、60μg/mL的对照品溶液，各进样10μL，按上述色谱条件测定，记录色谱峰面积，以进样量(μg)为横坐标(X)，色谱峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，结果表明进样量在0.115 7～0.694 2μg范围内线性关系良好，回归方程为：Y=787 926X-3 384.3，r=0.999 9 。

2.2.5 精密度试验考察 精密吸取对照品溶液10μL，注入液相色谱仪，连续进样6次，测定样品中橙皮苷色谱峰面积。测定结果RSD为0.96%，表明仪器精密度良好。

2.2.6 稳定性试验考察 精密吸取同一份供试品溶液，分别于配置后0、2、4、8、16、24h进样10μL，按“2.2.1”项色谱条件，测定样品中橙皮苷色谱峰面积。测定结果RSD为0.92%，表明供试品溶液制备24h内稳定性良好。

2.2.7 重复性试验考察 取同一批次乳癖消结丸样品6份，按供试品溶液制备方法提取、制备、测定，橙皮苷平均含量为1.21mg/g ，RSD为1.10%。测定结果提示，该实验重复性良好。

2.2.8 加样回收率试验考察 取已知含量的同一批号样品(批号：20140306)6份，每份约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入0.604 2 mg/mL(精密称取橙皮苷对照品15.85mg，加甲醇定容至25mL)的橙皮苷对照品1mL，按“2.2.2”项方法配制供试品溶液，按“2.2.1”项色谱条件测定橙皮苷含量，计算回收率。结果显示，平均回收率为96.9%，RSD为0.9%(n=6)。见表3。

2.2.9 样品测定 取3个不同批次样品，按供试品制备方法制备供试品溶液，按上述色谱条件，注入液相色谱仪，测定色谱峰面积。结果见表4。

3 讨论

本实验对丹参酮ⅡA、橙皮苷成份冷浸后超声提取及直接超声提取方法进行考察，研究发现冷浸后超声提取含量较直接超声提取含量高，因此采用冷浸后超声提取。关于橙皮苷流动相的选择，比较不同比例的甲醇-磷酸和乙腈-磷酸溶液，研究发现甲醇-磷酸盐溶液会产生基线不稳，最终确定乙腈-磷酸溶液(21∶79)系统为流动相，该系统分离度和峰型均良好。

乳癖消结丸作为抚顺市中医院临床常用药，方中有效成分的含量可正面反映该制剂质量的优劣，因此应进行组方中药品成分含量的检测，更好地控制药物临床疗效及药品质量。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].一部.北京：化学工业出版社，2010.

[2] 刘静，戴忠，王钢力，等.丹参活性成分及相关分离分析方法研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2012，18(11)：288-295

[3] 于百青，杨 敏，孙鹏云．高效液相色谱法测定心舒丸中丹参酮ⅡA含量[J]．中国药业，2012，21(13)：36-37．

[4] 吴德明，董茂臣，唐文君．高效液相色谱法测定乙肝扶正胶囊中丹参酮ⅡA的含量[J]．黑龙江中医药，2012(2)：49-50．

[5] 张瑞．HPLC法测定橘红片中橙皮苷和柚皮苷的含量[J]．安徽医药，2013，17(3)：401-402．

[6] 张维，张志云，礼彤，等．HPLC法同时测定冠脉康片中橙皮苷和芍药苷的含量 [J]．辽宁中医药大学学报，2013，15(8)：53-55．

[7] 刘玉春，张 静．HPLC同时测定橘红枇杷胶囊中橙皮苷、柚皮苷的含量[J]．安徽医药，2013，17(12)：2044-2045.

(责任编辑：李岚春)

Content Determination of TanshinoneⅡA and Hesperidin in Rupixiao Node Pills by HPLC method.

ZhanG He1, Ma Ning2

(1.Liaoyang Institute for Food and Drug Control, Liaoyang 111000,China;2.Fushun Hospital of Traditional Chinese Medicine,Fushun 113008,China)

Objective:To establish the content determination of tanshinoneⅡA and hesperidin in Rupixiao node pills by HPLC. Methods:The column was Diamonsil C18(200mm×4.6mm,μm), Tanshinone II A mobile phase was methanol-water (75∶25),detection wavelength was 270nm, flow rate was 1mL/min .The column temperature: 30 ℃. Hesperidin the mobile phase was 0.2% phosphoric acid solution (21∶79), detection wavelength was 284nm, flow rate was 1mL/min. The column temperature: 25℃.Results:Tanshinone IIA in 0.040 3μg～0.403 2μg showed a good linear relationship with the peak area range, The regression equation was: Y=3E+06X-38932(r=0.9997).The average recovery was 96.4%, with RSD of 1.6%(n=6). Hesperidin in 0.115 7～0.694 2μg showed a good linear relationship with the peak area range, The regression equation was: Y=787 926X -3 384.3(r=0.999 9).The average recovery was 96.9%, with RSD of 0.9%(n=6).Conclusion:The method was used to determine the content of nodes in Rupixiao pills of tanshinone A and hesperidin simple and stable, high sensitivity, good reproducibility, Can be used as reference for the effective control of the drug quality.

Rupixiao Node Pills; TanshinoneⅡA; Hesperidin; HPLC

2015-01-27

张鹤(1982-)，女，辽宁省辽阳市食品药品检验所主管中药师，研究方向为中药检验及质量标准。E-mail：95137509@qq.com

R286.0

A

1673-2197(2015)12-0024-03

10.11954/ytctyy.201512010