★ 白黎明 白扇扇 崔小虎 张晓双 (．陕西中医药大学附属医院脑病科 陕西 咸阳7000;．陕西中医药大学 陕西咸阳7046)

睡眠是恢复精力体力所必须的休息，睡眠剥夺(sleep deprivation)就是指各种原因所导致的睡眠减少或睡眠时间严重不足，是由于生理、病理因素或环境的影响而丧失了所需睡眠量的状态，睡眠剥夺可导致机体认知功能的损害［1］。酸枣仁汤是由炒枣仁、茯苓、川芎、知母和甘草5味中药组成，具有养心安神等功效。现代医学研究表明酸枣仁汤抗焦虑、镇静催眠和抗惊厥作用、广泛地用于治疗心悸、失眠等病［2］。本课题复制大鼠睡眠剥夺模型，考察酸枣仁汤对睡眠剥夺后大鼠学习记忆、病理学、海马组织一氧化氮和一氧化氮合酶的影响。

1 材料与方法

1．1 动物 ♂SD大鼠，SPF级，体重(250±20)g。由西安交通大学医学院实验动物中心提供，实验动物质量许可证号:SCXK(陕)2007－001。

1．2 药品及试剂 SZRT水煎剂(炒酸枣仁15g，茯苓6g，川芎6g，知母6g，炙甘草3g)的所有药材均购自陕西省药材公司，煎煮后浓缩至2．1g生药/mL的药液，分装后置4℃冰箱保存。考马斯亮蓝蛋白，NO，NOS测试盒，批号分别为20100108，20100113，20100113，均购于南京建成生物工程研究所。

1．3 器材 睡眠剥夺箱(自制);Y－迷宫(张家港市生物仪器厂)。KDC－160HR高速冷冻离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司);DM4000B LED智能型生物显微镜(德国Leica);GB－204型电子天平(瑞士梅特勒有限公司)。

1．4 分组、造模［3］、给药 ♂SD大鼠，随机分为大平台对照组(对照组)、睡眠剥夺组(模型组)、SZRT高、中、低剂量组(21，10．5，5．25g生药/kg)。连续7d进行睡眠剥夺，在睡眠剥夺箱(90 cm×70 cm×50 cm)中放置10个小平台(直径6．5 cm，高8.0 cm)，平台之间距离15cm，平台周边注满水，水面距平台面约1．0cm，大鼠在平台上可饮食饮水，如果入睡就会落入水中，大鼠只能爬上平台，这样反复多次可达到睡眠剥夺的效果。对照组采用大平台(直径12cm，高8．0cm)作为对照，大鼠可以在大平台上睡眠，入睡不会落入水中。对照组和模型组则灌服等体积的蒸馏水。SZRT高、中、低剂量组，造模期间每天ig SZRT水煎液，给药体积l0mL/kg，连续给药7d。

1．5 Y－maze［4］Y－maze主要应用于动物的辨别性学习，工作记忆及参考记忆的测试。它由一个中心区和其周围连接的三条臂组成，每个臂的末端有发光源，发光臂为安全区，反之。先将大鼠放入迷宫中适应3～5min。采用随机不休息法，安全区以无规则的次序变换开始时，对大白鼠所在支臂与另一支臂通电，动物在电击下逃窜至灯光区后再保持l0s或30s为一次测试。然后动物所在支臂为下次测试的起始位置进行下一次测试。测试在第0d和7d进行。考察指标:(1)错误反应次数(error number，EN):每个实验日进行20次训练测试，一个实验日完成所有反应中错误反应的次数。(2)主动回避率(Active avoidance reaction ratio，AAR ratio):大鼠在灯亮后但未通电的5s内完成逃避反应的次数占总反应次数的百分率。安全区灯亮，电刺激尚未开始时，大鼠即逃往安全区表明大鼠已经形成了明暗辨别条件反射。

1．6 HE 每组取3只大鼠ip 10%水合氯醛3.0mL/kg麻醉，开胸暴露心脏，将穿刺针通过左心室进入升主动脉，剪开右心耳，先快速灌注37℃生理盐水250mL，再缓慢灌注新鲜配置的4℃含4%多聚甲醛的0．1mol/L的磷酸缓冲250mL，断头剥离颅骨，完整取出大脑，投入到4%多聚甲醛中固定。制备石蜡切片。HE染色观察大鼠海马CA1区形态学。

1．7 海马NO含量和NOS活性 各组剩余大鼠断头取脑，取海马，在4℃的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重，加入冷生理盐水，于匀浆管中充分研碎，制成10%的脑组织匀浆，3000 r/min离心15min取上清液，硝酸还原酶法测定NO含量，化学比色法测定NOS活性。

2 结果

2．1 Y－maze 结果见表1。由表1可见，造模前各组大鼠的EN和AAR ratio无显著性差异(P＞0.05)。造模第7d，与对照组比较，模型组EN明显增多，AAR ratio明显减少(P＜0．01)，与模型组相比，SZRT高剂量组EN明显减少(P＜0．05)。AAR ratio增多(P＜0．01)。

表1 各组大鼠Y－maze实验结果(¯x±s，n=10)

图1 各组大鼠海马CA1区形态学(HE×200)

2．2 HE 结果见图1。由图1可见，对照组大鼠海马CA1区可见紧密排列的锥体细胞。神经细胞核仁、核膜清晰可见，胞浆染色正常;模型组大鼠海马CA1区锥体细胞排列紊乱，部分神经元大小不一，呈三角形或不规则形，胞浆嗜酸性增强，核固缩;SZRT组和模型组相比，神经细胞核固缩减少，神经元变性程度减轻，海马CA1区完整锥体细胞数明显增多。2．3 NO含量和NOS活性 结果见表2。由表2可见，与对照组比较，模型组大鼠海马中NO含量和NOS活性提高(P＜0．01);与模型组比较，SZRT高剂量组NO含量和NOS活性降低(P＜0．05)。

表2 各组大鼠海马NO含量和NOS活性的影响(¯x±s，n=10)

3 讨论

随着生活节奏的不断加快和特殊部门工作的需要，睡眠剥夺是一种非常普遍的现象。睡眠可影响动物的行为和生理功能，如学习记忆和认知能力［5］。睡眠剥夺日益危害人类健康，也是导致人体亚健康主要原因之一。睡眠剥夺对机体可造成危害，临床及动物试验均表明睡眠剥夺可引起一系列综合症:如消瘦，能量消耗增多，血清儿茶酚胺类激素增多，体内神经递质的紊乱和激素水平的异常，机体免疫功能下降及条件性致病菌感染机会增加等。海马区神经元的变化是学习记忆功能改变的基础。NO是一种自由基气体，参与脑内许多生理病理过程，如脑血流调节、学习记忆形成等［6］。睡眠剥夺后可导致机体NO的增多，而NO具有促进睡眠的作用，引起疲劳感和睡意。NO可通过第二信使环磷酸鸟苷(cGMP)消除氧自由基，保护脑细胞，但过量的NO又可激活氧自由基，损害脑细胞［7］。随着睡眠剥夺时间不断增加，可使诱导型NOS激活，产生大量具有神经毒性的NO。前期本课题组研究结果提示酸枣仁汤可改善睡眠剥夺大鼠学习记忆，可能与抑制神经细胞的凋亡和改变单胺类递质的含量，保护胆碱能系统和抗氧化作用有关［8－9］。本次实验的结果表明复方酸枣仁汤可提高睡眠剥夺后大鼠的学习记忆能力，可能与降低NO含量，抑制NOS活性有关。而具体机制还需要进一步探索。

［1］Giam GCK．Effeets of sleep deprivation with reference to military operations［J］．Annimals Academy of Medicine，1997，26(1):88－91．

［2］徐小平，胡锐，席志芳．复方酸枣仁汤的药效学研究［J］．西北药学杂志，2002，17(5):210－213．

［3］范新六，李峰，宋月晗，等．加味四逆散对睡眠剥夺大鼠PFC和海马CA3区NMDA受体表达的调节作用［J］．世界中医药，2012，7(3):261－262．

［4］王跃春．Y－型电迷宫在大鼠学习记忆功能测试中的合理运用［J］．中国行为医学科学，2005，14(1):69－70．

［5］VILLALOBOS C，ANDRADE R．Visinin－like neuronal calcium sensor proteins regulate the slow calcium－activated after－hyperpolarizing current in the rat cerebral cortex［J］．J Neurosci，2010，30(43):14 361－14 365．

［6］马婧怡，张万鑫，陈虹，等．松果菊苷对血管性痴呆大鼠氧化应激损伤的保护作用［J］．中国药理学通报，2014，30(5):638－642．

［7］郜红利，涂星，卢映，等．土家苗药夜关门对小鼠实验性失眠的疗效观察与机制初探［J］．中成药，2014，36(2):63－66．

［8］张晓双，，孙建宁，白黎明．酸枣仁汤对睡眠剥夺大鼠学习记忆的影响及机制研究［J］．中药药理与临床，2014，30(4):8－11．

［9］张晓双，白黎明，孙建宁．酸枣仁汤对睡眠剥夺模型大鼠学习记忆的影响［J］．中国药房，2015，26(7):915－917．