李 凤 孙 宁 王 赫 刘敏洁 王伶云 胡洪宇 赵玉雯

（1.天津农学院农学与资源环境学院，中国 天津300384；2.深圳市万信达生态环境股份有限公司，广东 深圳518026）

0 引言

北海道黄杨（Euonymus japonicus）为卫矛科、卫矛属的常绿阔叶树种。其树形有明显的主干，树体高大，叶片为卵形或椭圆形，四季常绿，且能开花结果，入冬后，其成熟的果实会开裂，露出红色的种子，镶嵌于绿叶丛中，红果绿叶，具有较高的观赏价值。北海道黄杨抗白粉病、黑斑病能力较强，吸收有害气体的能力强，对二氧化硫、氢气、氟化氢等有害气体都有很强的抗性[1]。北海道黄杨的抗逆性强，适应性强，能耐寒、耐干旱，在-23.9℃时仍能保持绿色；其生长速度快，年平均生长量约为70 cm，比普通大叶黄杨生长速度快3~5倍。其四季常绿、无污染的特性决定了能够成为优良的北方城镇街道绿化树种。

本文以北海道黄杨叶片为试材，对其离体培养条件下愈伤组织的诱导、增殖与分化状况进行了初步研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以北海道黄杨叶片为试材。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体消毒

采集完整无病虫的新生叶片和老熟叶片为外植体，在流水下冲洗后，无菌条件下在75%酒精中浸泡30s，用蒸馏水冲洗3次，后用0.1%氯化汞浸泡6min，无菌水清洗5次，放置于无菌滤纸上吸干水分。

1.2.2 叶片愈伤组织诱导试验

将叶片剪为1cm2左右带叶脉的方形叶块，接种在不同配方的培养基上。基本培养基采用MS（蔗糖30g/L、琼脂6.3g/L，pH6.0），附加不同浓度的6-BA、NAA、2,4-D，共设10个处理。培养温度25℃，暗培养。接种后定期观察统计叶片生长情况。

1.2.3 叶片愈伤组织分化试验

无菌条件下，将诱导出的愈伤组织用刀片切成小块接入到不同浓度处理的培养基中。基本培养基采用MS（蔗糖30 g/L、琼脂6.3 g/L，pH6.0），附加不同浓度的6-BA、NAA、KT、IBA、ZT、2,4-D，共设12个处理。培养温度25℃，光照强度2000lx左右，光照时间12h/d。接种后定期观察愈伤组织的生长情况。

2 结果与分析

2.1 叶片离体培养状况

老熟叶片接种在诱导培养基中培养15d后，愈伤组织诱导开始启动，叶片边缘切口处开始出现乳白色的愈伤组织，质地坚硬，但是此时的愈伤组织较小，厚度约为0.05mm；接种30d后，愈伤组织的生长发生明显变化，此时为愈伤组织生长的最旺盛时期，叶片四周的愈伤组织厚度约为0.1cm左右，此时的颜色为黄白色，质地坚硬。此后，随培养时间延长，愈伤组织逐渐开始慢慢褐化，由黄白色变为浅褐色，再变为深褐色，质地也由坚硬慢慢开始变得疏松。培养40d后，愈伤组织诱导启动较早的且长势较好的愈伤组织叶片大部分都已褐化，此时这些长势较好的愈伤组织厚度大小约为0.3~0.4cm，而愈伤组织长势较差的愈伤组织则已经完全褐化，且厚度只有0.1cm左右。

新叶作为外植体时，其叶片诱导愈伤组织的启动时间则会相对的早于老叶，其诱导的愈伤组织为黄绿色，质地坚硬，并且叶脉处也有愈伤组织长出，而老叶虽也有部分叶片的叶脉处长出愈伤组织，但是极少于新叶；新叶愈伤组织褐化衰老时间也晚于老叶愈伤组织。

2.2 外源激素对叶片诱导愈伤组织的影响

由表1可以发现，虽然处理A2愈伤组织诱导率高达82.3%，但诱导出的愈伤组织量很小；而处理A8与A10诱导率相对较高，均为80%，且愈伤组织形成的量也较多；A7诱导率相对较低，为59%，但诱导形成的单块愈伤组织体积较大。

表1 不同激素对叶片诱导愈伤组织的影响（30d）

将未诱导出愈伤组织、诱导出少量愈伤组织和诱导出少量愈伤组织且褐化的3种叶片再次转接入处理A8与A10中进行培养。经过10d后，原本未诱导出愈伤组织的叶片四周开始长出黄白色的愈伤组织，质地疏松为颗粒状；而原有少量愈伤组织的叶片四周也开始继续增殖愈伤组织，同样为黄白色，质地疏松；诱导出愈伤组织但愈伤组织褐化的叶片，能够在本已褐化了的组织周围长出新的透明带浅黄色的新的愈伤组织，其质地柔软疏松。在转移接种21d后，新生愈伤组织的厚度在0.6-1.2cm之间，呈黄绿色至乳白色。（见图1）

图1 愈伤组织诱导培养（左：培养30d；右：二次转接A10培养21d）

2.3 外源激素对愈伤组织分化培养的影响

将叶片诱导获得的愈伤组织接种到添加不同浓度激素组合的培养基中进行光培养，10d后，B5处理的培养瓶中有少数愈伤组织开始有黄白色转为绿色。由表2中可以看出，在12组处理中，B1、2、4、5、9这5组处理中的愈伤组织转绿，其余的处理都是愈伤组织进行了不同程度的增殖。培养14d，B1、B2、B4 3个处理都开始出现少量转绿的愈伤组织。接种19d后，B2处理中转绿的愈伤组织增多，B5中每块愈伤组织上都有小部分转绿。接种55d后，各处理配方中培养的愈伤组织均未分化出芽。

3 小结

在叶片诱导愈伤组织阶段，MS+2,4-D1.5mg/L和MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L这两个配方对愈伤组织的诱导效果最好，诱导率与愈伤组织量较高，并可作为愈伤组织的继代培养基。在外植体的选择上，新叶的诱导效果比老叶好，大部分新叶不仅叶片四周的切口处诱导出愈伤组织，叶脉处也会诱导出愈伤组织。

表2 不同激素配比对愈伤组织分化出芽的影响

在愈伤组织分化培养试验中，虽然未能分化出芽，但是发现NAA0.1mg/L与6-BA的激素组合能够刺激愈伤组织转绿。马杰[2]等学者利用金边北海道黄杨的叶片作为外植体，在MS培养基诱导出不定芽，6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L时效果最好。在其他学者的研究中发现，当有大量颗粒状球形胚产生时可将其转移到芽诱导培养基上进行不定芽的诱导，此时由于愈伤组织正处于分化旺盛期，应适当降低激素用量或者去除细胞分裂素[3]。因此可以确定6-BA具有诱导分化出芽的作用，但是针对不同品种其适宜的6-BA浓度还需要探索。而ZT与2,4-D的激素组合则会诱导出质地坚硬的白色愈伤组织。

对北海道黄杨叶片离体培养愈伤组织的获得及其分化培养的初步研究，为北海道黄杨再生体系的成功建立奠定了技术基础，并将为后续北海道黄杨细胞诱变、离体快繁、基因转化等相关研究提供理论参考。

［1］王新生.北海道黄杨的特性和用途[J].中国林业，2008(10)：44.

［2］马杰，郭利勇，崔波，等.金边北海道黄杨再生体系的建立及其快繁初探[J].安徽农业科学，2008，36(6)：2245-2246，2346.

［3］曹孜义，刘国民.实用组培教程[M].兰州：甘肃科学技术出版社，1996：78-80.