孙吉凤 刘剑凯 张淑芳

黄芩素（baicalein，BAI）是从传统中药黄芩的根中提取出的一种主要有效成分，它属于黄酮类化合物[1]。一些以黄芩素作为主要成分的制剂应用于抗菌、抗病毒、抗过敏、抗血栓等多种方面疾病的治疗[2-3]。近几年来，一些研究表明，黄芩素可以抑制胰腺癌、皮肤癌、宫颈癌细胞等的增殖，诱导凋亡[4-6]，但具体作用机制尚待深入研究。喉癌是一种常见的头颈部鳞状细胞癌，具有预后不良、高死亡率等特点，局部发生转移的患者又以预后不良、高死亡率为特点[7-10]。目前国内外尚未见黄芩素对喉癌的抑制作用相关研究。本实验拟对不同浓度黄芩素对人喉癌Hep-2细胞的生长抑制和诱导凋亡作用进行研究，从而为进一步阐明黄芩素的抗癌机制及临床应用提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 人喉癌Hep-2细胞购于上海细胞生物研究所。黄芩素（Baicalein）购于美国SIGMA公司，用DMSO溶解后配成贮存液置于-20 ℃冰箱保存，实验时稀释至所需浓度。胎牛血清、四甲基偶氮唑蓝（MTT）、台盼兰和吖啶橙（AO）购于北京鼎国生物技术公司。RPMI1640培养基购于GIBCO/BRL公司。

1.2 细胞培养 喉癌细胞株Hep-2于含5%胎牛血清FBS（经56 ℃ 30 min灭活），100 U/mL青霉素及100 μg/mL链霉素的RPMI1640培养液中，单层细胞培养；37 ℃ 5% CO2孵箱中培养传代，每次传代均以0.25%胰蛋白酶消化，洗涤一次，更换新培养基。取对数生长期的细胞用于后续实验。

1.3 MTT法检测细胞增殖 取对数期生长的Hep-2细胞按每孔5×103个细胞接种于96孔培养板中，用5%FBS的RPMI1640培养液培养24 h后，更换成无血清的RPMI1640培养液同步化培养24 h，再更换成5%FBS的RPMI1640培养液，并加入黄芩素（10、20、40、80 μmol/L），每组药物浓度设5个复孔，同时设不加药物的阴性对照（加入溶剂DMSO）和不接种细胞的空白对照。在CO2孵箱中分别培养24 h及48 h后，每孔加入20 μL MTT，继续孵育4 h后，弃上清液，加入150 μL DMSO， 轻轻振荡10 min，等结晶物完全溶解后，利用酶标仪，在570 nm波长处检测各孔A值，按细胞增殖抑制率（%）=（1-药物处理组A570值/阴性对照组A570值）×100%计算药物对细胞增殖的抑制率。

1.4 台盼兰染色法检测细胞活力 取对数期生长的Hep-2细胞，按每孔5×103个细胞接种于24孔培养板中，每孔1 mL，5%FBS的RPMI1640培养液培养24 h后，更换成无血清的RPMI1640培养液同步化培养24 h，最后再更换成5%FBS的RPMI1640培养液，并加入终浓度分别为10、20、40、80 μmol/L的黄芩素1 μL，每组药物浓度设5个复孔，同时设不加药物的阴性对照（加入溶剂DMSO）。细胞加药后置于37 ℃、5%CO2孵箱中孵育48 h后，制成单细胞悬液。再用0.4%的台盼兰染色，染色2~3 min，并在光学显微镜下计数拒染的活细胞。每瓶取5个视野，数100个细胞，计数该视野内的活细胞数和死细胞数；实验重复5次，求平均值，并计算细胞活力=平均活细胞数/（平均活细胞数+平均死细胞数）。

1.5 吖啶橙染色法检测细胞凋亡 采用吖啶橙（acridine orange，AO）染色法观察黄芩素对Hep-2细胞形态的影响。取对数期生长的Hep-2细胞，以4×104细胞数接种于24孔板中，5%FBS的RPMI1640培养液培养24 h后，更换成无血清的RPMI1640培养液同步化培养24 h，最后再更换成5%FBS的RPMI1640培养液，并加入终浓度为40 μmol/L及80 μmol/L的黄芩素，每组药物浓度设5个复孔，同时设不加药物的阴性对照（加入溶剂DMSO）培养48 h后，取出载玻片，PBS洗两次，滴加0.01%的吖啶橙，在荧光显微镜下观察细胞形态，并照相。

1.6 统计学处理 用SPSS 13.0统计软件对实验数据进行统计学分析，计量资料以（x-±s）表示，重复测量的计量资料采用方差分析，其他用单因素方差分析或t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 黄芩素对Hep-2 细胞增殖的影响 图1为黄芩素（10、20、40、80 μmol/L）作用24、48 h后，对各组细胞增殖的影响。其中24 h作用组中，各浓度的抑制率分别为（8.23±0.05）%、（19.48±0.04）%、（53.85±0.07）%、（86.54±0.04）%，组间比较差异具有统计学意义（P<0.05）；48 h作用组中，各浓度的抑制率分别为（14.52±0.11）%、（34.13±0.06）%、（69.85±0.03）%、（96.43±0.02）%，组间比较差异具有统计学意义（P<0.05）；说明不同浓度的黄芩素作用于肿瘤细胞，在一定浓度范围内（10~80 μmol/L），随剂量增加，黄芩素对Hep-2细胞增殖的抑制率增加，呈剂量依赖性。同时48 h作用组与24 h作用组，在不同浓度下的抑制率之间比较差异具有统计学意义（P<0.05），说明随着时间的延长，黄芩素的抑制增殖效应逐渐增强，呈时间依赖性。

图1 黄芩素（BAI）对Hep-2细胞增殖的影响

2.2 黄芩素对Hep-2细胞活力的影响 阴性对照组（DMSO）Hep-2细胞无药物刺激，细胞呈对数增长，在24、48 h内存活率无明显变化，均大于98%。表1为终浓度为10、20、40、80 μmol/L的黄芩素作用24、48 h后，台盼兰染色法的各组细胞计数后的统计分析结果。实验表明，与阴性对照组相比，不同浓度的黄芩素作用于Hep-2细胞，在一定浓度范围内（10~80 μmol/L），以时间-剂量依赖方式抑制Hep-2 细胞活力，差异有统计学意义（P<0.05）。

表1 黄芩素（BAI）对Hep-2细胞活力的影响（±s，n=5）

表1 黄芩素（BAI）对Hep-2细胞活力的影响（±s，n=5）

*与阴性对照组（加入溶剂DMSO）比较，P<0.05

B A I浓度 2 4 h 4 8 h阴性对照组（D M S O）9 8.6 5±0.2 3 9 8.0 0±0.0 4 1 0 μ m o l/L 7 8.0 0±0.2 5* 7 6.0 0±0.1 5*2 0 μ m o l/L 6 4.0 0±0.1 2* 5 3.0 0±0.3 1*4 0 μ m o l/L 3 6.0 0±0.1 8* 3 0.0 0±0.1 2*8 0 μ m o l/L 1 6.7 0±0.2 7* 9.4 0±0.1 8*

2.3 黄芩素对Hep-2细胞形态的影响 阴性对照组（加入溶剂DMSO）和终浓度为40、80 μmol/L的黄芩素作用于Hep-2细胞48 h后，经吖啶橙染色后，在荧光显微镜下放大40倍后观察细胞形态见图2。由图2可见，阴性对照组细胞处于完全贴壁状态，并且形态完整，具有伪足；终浓度为40 μmol/L的黄芩素作用48 h后，细胞的伪足已收缩，细胞质萎缩，出现凋亡小体；终浓度为80 μmol/L的黄芩素作用48 h后，因更多细胞坏死使得细胞相对更少，细胞近似卵圆形，细胞质萎缩，有凋亡小体，甚或见黄绿色碎片。

图2 AO染色法观察黄芩素对喉癌Hep-2细胞形态的影响（×40）

3 讨论

近年来研究表明，黄芩素作为中药黄芩的主要活性成分，还具有抗肿瘤作用。黄芩素对人白血病HL-60细胞、人乳腺癌MCF-7细胞、人皮肤癌细胞等有明显的增殖抑制作用[11-13]，并与促进肿瘤细胞凋亡有关。本实验对黄芩素对人喉癌Hep-2细胞的增殖、细胞活力及其诱导凋亡细胞形态展开研究。

本研究通过MTT法表明，终浓度为10、20、40、80 μmol/L的黄芩素，在作用24、48 h后，对人喉癌Hep-2细胞增殖具有抑制作用，且随浓度及作用时间增加，抑制率也增加，最高可达（96.43±0.02）%。说明终浓度为10~80 μmol/L的黄芩素在作用24、48 h后，对喉癌Hep-2细胞存在时间-剂量依赖的增殖抑制作用（P<0.05）。这与王竹君等[14]及张淑群等[15]对人食管腺癌OE33细胞及人乳腺癌MDA-MB-231细胞的研究结果相近。台盼兰染色法，是利用台盼兰对细胞膜受损的死细胞进行染色来研究药物对细胞活力影响的一种方法。通过本研究表明，终浓度为10~80 μmol/L黄芩素作用24 h后，使得Hep-2细胞活力由阴性对照组（加入溶剂DMSO）的（98.65±0.23）%降低到（16.70±0.27）%，作用48 h后，使得Hep-2细胞活力由阴性对照组（加入溶剂DMSO）（98.00±0.04）%降低到（9.40±0.18）%，说明对喉癌Hep-2细胞活力的抑制呈时间-剂量依赖性（P<0.05）。利用碱性荧光染料AO染色法，从形态学的角度检测到，终浓度为40、80 μmol/L的黄芩素作用48 h后，使得细胞伪足收缩，出现凋亡细胞，因细胞死亡使得贴壁细胞数明显减少。说明黄芩素（40、80 μmol/L）作用48 h，可诱导喉癌Hep-2细胞凋亡。

综上所述，黄芩素可显著抑制人喉癌Hep-2细胞的增殖、抑制细胞活力，诱导细胞凋亡。这些发现是对黄芩素在肿瘤细胞抑制作用方面的突破性认识，拓展了对黄芩素抗癌机制的研究。黄芩素作为一种药源充足、安全有效、价格低廉的中药成分，相信其在抑制喉癌方面将具有广阔的应用。此外，还需进一步对黄芩素抑制喉癌细胞增殖及诱导凋亡等的分子机制进行多方面的深入研究。

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