马旭东，赵 锋

（陕西省安康市环境保护监测站，陕西 安康725000）

1 概述

大肠菌群并非细菌学分类命名，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌，粪大肠菌群则是大肠菌群的一部分主要来自于粪便，因此粪大肠菌群的存在表明可能受到了粪便污染，可能存在大肠杆菌。

国家标准和行业标准中都对粪大肠菌群的检测（多管发酵法）作出了比较详细的规定，现就其两个标准中的异同作出如下探讨。

2 相同点

适用范围相同：行业标准和国家标准都适用于地表水、地下水和污水中的粪大肠菌群的检测。

原理相同：多管发酵法是以最可能数简称MPN来表示试验结果的。实际上它是根据统计学理论，估计水体中的大肠菌群密度和卫生质量的一种方法。如果从理论上考虑，并且进行大量的重复检定，可以发现这种估计有大于实际数字的倾向。不过只要每一稀释度试管重复数目增加，这种差异便会减少，对于细菌含量的估计值，大部分取决于那些既显示阳性又显示阴性的稀释度。因此在实验设计上，水样所要求重复的数目，要根据所要求数据的准确度而定。

3 不同点

（1）国家标准中规定水样采集前，需要在采样瓶中加入适量的硫代硫酸钠，用以消除或减小样品中的氯对于微生物正常生长的影响，而行业标准中没有相应的规定。

（2）国家标准中规定水样在分析时的稀释方法为取1mL水样注入到9mL灭菌生理盐水中混匀，若需要再次稀释则取上述稀释液1mL注入到9mL灭菌生理盐水中，以此类推。若接种量小于1mL时则必须作10倍递增稀释，并且还要注意的是每递增稀释一次，换用1支1mL灭菌刻度吸管，行业标准中没有相应的规定。

（3）对于不同的水样，国家标准中没有给出一个建议稀释度，而行业标准中有一个明确的稀释方法建议，见表1。

表1 行业检测稀释方法建议

（4）复发酵试验的方法不同，这一点也是最为重要的一点。行业标准中对于复发酵试验的规定是：轻微震荡初发酵试验阳性的发酵管，用3mm接种环或灭菌棒将培养物转接到EC培养液中。在44.5±0.5℃下培养24±2h。接种后所有发酵管必须在30min内放入水浴中。培养后立即观察，发酵管产气则证实为粪大肠菌群阳性。而国家标准中规定若复发酵有产气者，则转种于伊红美蓝琼脂平板上，置44.5℃培养18～24h，凡平板上有典型菌落者，则证实为粪大肠菌群阳性。即国家标准中在复发酵试验发酵管产酸或产气之后还需要进行一个平板分离和革兰氏染色见证试验才能证明水样中有无粪大肠菌群的存在，而行业标准中只要是复发酵试验产气则就能证明粪大肠菌群阳性。

4 革兰氏染色

4.1 原理

通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。

4.2 步骤

（1）涂片固定。

（2）草酸铵结晶紫染1min。

（3）自来水冲洗。

（4）加碘液覆盖涂面染约1min。

（5）水洗，用吸水纸吸去水分。

（6）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20s后水洗，吸去水分。

（7）蕃红染色液（稀）染1min后，自来水冲洗。干燥，镜检。

5 革兰氏染色对于粪大肠菌群检测的重要意义

在微生物学中，大肠杆菌是一种革兰氏阴性无芽孢的原核生物。相对于革兰氏阳性细菌来说，其特点是：细胞壁较薄、较疏松且肽聚糖含量较低。这就造成了在进行革兰氏染色时会在复染阶段被二次染色从而区别于革兰氏阳性细菌。

6 结论

（1）行业标准中没有对于采样时采样瓶的处理方法，故在实际操作中可以参照国家标准中的相关规定。

（2）行业标准中没有规定水样在分析时的稀释方法，故在实际操作中可以参照国家标准中的相关规定。

（3）在实际的分析工作中分析人员可以根据这个稀释方法以及平时对于该项目的积累可以尽可能少地选择一个或者几个稀释度对样品进行分析，从而减少因稀释度的选择不合适而造成的各种浪费。

（4）就算按照国家标准的规定，每个样品在复发酵之后还要对其阳性试管进行分离鉴定及革兰氏染色，而在分离鉴定和革兰氏染色过程中仍然会有可能因操作手法、试剂或其他偶然因素而造成鉴定结果出现假阳性或假阴性，从而对粪大肠菌群的整个实验结果造成偏离甚至是错误。

而在行业标准的复发酵过程中，如果发酵管中根本不存在大肠杆菌，而是存在一些其他种类的革兰氏阳性细菌，而革兰氏阳性细菌在发酵过程中也必然会产气。这时只要发现其产气就认定为粪大肠菌群阳性是否欠妥。

7 建议

总大肠菌群、粪大肠菌群和细菌总数等都是属于生物监测项目，并常常与其他各种化学项目同期采样。因这两个标准中都没有对于生物项目和化学项目在采样时应注意的先后顺序，从而导致经常会出现在同一个采样点位先采化学项目、后采生物项目，或者化学项目与生物项目交替进行采样的情况，而这些情况势必会对生物项目的水样造成影响。希望下次修订标准的时候可以考虑这个情况。

［1］中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会.生活饮用水标准检验方法 微生物指标 GB/T 5750.12－2006［S］.北京：中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会：2006.

［2］国家环境保护部.水质粪大肠菌群的测定多管发酵法和滤膜法HJ/T347－2007［S］.北京：国家环境保护部，2007.

［3］周德庆.微生物教程［M］.2版.北京：高等教育出版社，2002.

［4］沈 萍.微生物学实验［M］.4版.北京：高等教育出版社，2007.

［5］国家环境保护总局，国家质量监督检验检疫总局.地表水环境质量标准GB3838－2002［S］.北京：国家环境保护总局，国家质量监督检验检疫总局，2002.

［6］周群英.环境工程微生物学［M］.3版.北京：高等教育出版社，2000.