王　振，张　斌，王养民

精原干细胞的研究进展

王振，张斌，王养民

[摘要]在生物医学领域中，干细胞已成为目前研究的热点，并从基础医学研究向临床应用方面快速转化。干细胞根据其特性一般可分为成体干细胞、多能干细胞和胚胎干细胞，而应用于临床的成体干细胞在治疗多种疾病时表现出了巨大的优势。精原干细胞(spermatogonial stem cells， SSCs)是精子形成的前体细胞，具有自我增殖和多向分化的潜能，是雄性动物中唯一能将遗传信息传递给后代的成体干细胞。SSCs培养与移植技术的发展不仅给男性不育患者带来了希望,同时也为整个人类生殖医学的发展提供了强有力的科学依据。

[关键词]成体干细胞；细胞培养技术；诱导；不育,男(雄)性

[DOI]10.3969/j.issn.2095-140X.2015.09.021

不育是目前威胁人类健康发展的重要因素，且随着职业、环境和生活方式等因素的影响，男性不育的发病率不断增加[1-3]，而单纯的药物治疗或辅助生殖技术对于内源性生殖细胞缺如所致的无精症和精子畸形综合征患者来说无法达到生育目的。精原干细胞(spermatogonial stem cells， SSCs)具有自我更新的能力，可在正常成年男性生命期间通过有丝分裂和减数分裂不断增殖并分化形成精子[4]。因此，通过SSCs培养并诱导精子形成将给男性不育患者带来希望。本文对SSCs的演变、微环境、鉴定、培养以及在治疗男性不育等方面的应用前景进行综述如下。

1SSCs的演变

SSCs主要生长于雄性动物睾丸生精小管基底膜区域并维持其正常生殖能力的生殖干细胞，由早期胚胎的原始生殖细胞逐渐发育而来。原始生殖细胞来源于外胚层细胞，从卵黄囊基部被整合到正在形成的后肠中，沿后肠主动迁移，并在迁移途中分裂增殖，最终形成前体细胞。对于雄性动物而言，出生后前体细胞分化形成未分化型精原细胞和分化型精原细胞，前者认为具有干细胞活性,最终分化为精子。另外，在正常生精上皮中，SSCs的自我更新和分化的比率基本上为1︰1。根据SSCs的形态学特点，可将小鼠A型精原细胞分为As型、Apr型和Aa1型，仅As型精原细胞具有干细胞活性。Apr型精原细胞进一步分裂形成Aa1型精原细胞，后者再分裂形成A1型精原细胞，As/Apr/Aa1型精原细胞多分布在微环境中，当它们分化成为A1型精原细胞时将会迁出此区域[5]。A1型精原细胞经过连续6次分裂形成A2型精原细胞，后者最终分化成为B型精原细胞[6]。在分化过程中，SSCs需经历As型向Apr型精原细胞的转变，Aa1型向A1型精原细胞的转变以及A1型向B型精原细胞转化的3个关键点[7]。B型精原细胞最终分化形成精子细胞，进而形成精子，当与卵子结合形成受精卵后可将遗传信息传递给下一代。因此，SSCs承载着传递物种遗传信息的重大责任。

2SSCs的微环境

SSCs所存在的曲细精管区域在男性的一生中起到支持SSCs增殖和自我更新的作用。曲细精管及其周围的间质组织由各种不同的细胞组成，为精子生成提供各种激素、生长因子和细胞因子，从而调节微环境中SSCs的自我更新和增殖。由于SSCs的自我更新和分化既受到微环境的刺激，又受到胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、Plzf和c-kit等许多基因的精确调控，SSCs在离开微环境后会发生分化[8]。另外，在SSCs的微环境中，活性氧是第二信使，SSCs从增殖到生长抑制，再到衰老甚至死亡，均受到活性氧的干预[9-10]。维生素C可以调节活性氧的含量，保护细胞免受活性氧的损坏，促进SSCs的增殖[11-12]。在微环境中，支持细胞仅占睾丸组织细胞总数的3%，是唯一直接与SSCs接触和作用的体细胞，是SSCs微环境的重要组成细胞。另外，干细胞增殖与分化的平衡受到微环境的调控，微环境中促进和诱导SSCs更新与分化的因子主要包括转化生长因子β(TGF-β)、GDNF、成纤维细胞生长因子2(FGF2)、集落刺激因子1(CSF1)、锌指蛋白(PLZF)以及Ets家族转录因子等。因此，微环境是体外构建SSCs培养体系的重要参考依据。

3SSCs的鉴定

鉴定SSCs的方法主要包括功能性鉴定和特异性标志物鉴定。目前，SSCs的鉴定主要是功能性鉴定，方法是将分离后细胞再植入到动物睾丸的生精小管中，通过其增殖分化的情况判断所分离的细胞中是否含有SSCs。1994年，异种及异体移植小鼠SSCs实验表明SSCs不但可以在合适的体外培养条件下长期存活，而且可以通过移植SSCs的手段使原来不育的小鼠重新获得产生精子细胞的能力。随后，又有其他哺乳动物SSCs的移植实验报道，Honaramooz等[13]行山羊SSCs移植实验，虽未产下后代，但产生了携带阳性基因的精子，受精后有阳性胚胎形成。生物特异性标志物分离与鉴定是最准确可靠的鉴定SSCs的方法。研究发现，干细胞所表达的标志物常包括GFRa1，POU3F1，POU5F1(OCT4)，ZBTB16(PLZF)，NGN3，NANOS2，NANOS3，SOHLH1，SOHLH2，FOXO1，ITGA6(α6-integrin，CD49f)，LIN28，ID4，UTF1，CDH1，GPR125，ITGB1(b1-integrin，CD29)，EPCAM(CD326)，CD9和THY1(CD90)[14]。现已证实人类SSCs可以表达UTF1,Oct4，SALL4,ZBTB16,GFRa1,UCHL1,GPR125,LIN28,EXOSC10,FGFR3,DSG2,CBL,SSX2，Thy-1，c-kit和OCT2等多种表面标志物。另外，Foxo1也是SSCs的表面标志物，其免疫染色可作为未分化精子的一项检测指标[14]，且具有较好的鉴定效果，对于SSCs稳定性的维持和启动精子的产生具有重要意义。尽管以上标志物均可用来鉴定SSCs，但鉴定SSCs的特异性表面标志物仍然缺乏[15]。目前，应用流式细胞仪细胞分选技术可分离和纯化小鼠的SSCs[16]。其中，早期胚胎细胞所表达的相同型SSCs的表面标志物SALL4，常被用于流式细胞仪细胞分析[17]。另外，在磁珠分选分析时，ITGA6+和THY1dim常被用于从含有不同细胞成分的睾丸组织细胞悬液中高效地分离和纯化人类SSCs。近年来，通过研究多种表面标志物(如β1整合蛋白、α6整合蛋白、Oct4,和VASA)的表达发现[11,18-20]，β1整合蛋白和α6整合蛋白不仅表达于SSCs，也表达于其他体细胞和睾丸组织细胞，无法作为鉴定SSCs的特异性表面标志物。只有Oct4和VASA在一些体细胞和睾丸组织细胞中不表达[20]。目前，Oct4、Thy-1、GFRa-1和c-kit常作为鉴定SSCs的表面标志物，但金标准依然是SSCs的功能性鉴定。

4SSCs的分离

SSCs原代分离是体外研究的基础。目前，国内SSCs的分离、纯化主要集中在小鼠，经纯化后其纯度可达68.8%[21]。对于人类SSCs而言，由于其在睾丸组织中含量甚少，仅占生殖细胞的1/10 000,且细胞特异性表面标志物缺乏，给人类SSCs的分离和纯化带来了很大困难。因此，如何提高人类SSCs的分离效率是SSCs研究的关键之一。目前，分离SSCs常用差异贴壁法、离心法和流式细胞仪分选法。差异贴壁法根据SSCs与体细胞及睾丸组织内的支持细胞是否贴壁而进行分离，支持细胞和体细胞较SSCs易于贴壁，且在4～6 h内可完成贴壁，研究认为细胞在初次培养4 h后收集的SSCs纯度最高[22]，说明培养时间是一个重要的影响因素；离心法是根据各细胞间不同的比重而设计的；流式细胞仪分选法是采用SSCs的表面标志物免疫荧光技术分选阳性细胞。以上方法均已应用于实验，且2010年由He等采用差异贴壁法分离出了人的精原细胞。

5SSCs的培养

国内外对于SSCs的培养尚缺乏完善的培养体系[23]，且其培养方法复杂，培养成分不明确。目前，对于普通培养，研究者多采用以小鼠胚胎成纤维细胞为饲养层，以无血清或少量血清(含1%血清)的DMED/F12为基础培养基，再加入多种营养因子和细胞因子进行培养。在培养过程中，饲养层细胞可为干细胞提供多种必要的细胞因子和递质，他们与干细胞之间的相互作用是干细胞体外生存的重要条件。目前认为神经胶质细胞衍生的GDNF是SSCs自我增殖和存活的重要因子[24-25]，只要在基础培养基中添加GDNF和bFGF即可促进小鼠SSCs增殖形成克隆,GFRA1并不是必需的生长因子,但添加GFRA1能进一步加快SSCs的增殖[26]。培养温度、活性氧等也是影响SSCs产生的因素。另外，枸杞多糖对SSCs的体外增殖有促进作用，联合加入胶质细胞源性GDNF与白血病抑制因子可使SSCs的增殖作用更加明显[27]。对于较少接种数目SSCs的培养，微滴培养法实现了大鼠SSCs的增殖，尤其是接种数目少于5个细胞的微滴培养同样可以实现大鼠SSCs的扩增，这将为SSCs的进一步研究提供新的技术支撑[28]。

近年来，为了简化培养方法，明确培养成分，研究者一直在尝试着构建一种完善的SSCs培养体系。有报道发现,血清对SSCs的长期培养造成负面影响,导致其分化[29-30]。因此，培养液血清浓度从1998年的10%降至2002年的1%，2008年培养液已转变为既无血清又无饲养层细胞。然而，已有研究报道血清可以促进SSCs的生成，且在含有低浓度血清的培养基中SSCs的生成状况优于无血清培养。因此，血清对于SSCs的培养所产生的利与弊，需要在进一步的实验中得到证实。

最近研究显示，在SSCs分离后的两代以内的细胞培养过程中，由于细胞悬液中体细胞和睾丸组织细胞的存在，SSCs的增值状态不稳定，再加上SSCs在培养液中呈悬浮状态生长。因此，SSCs的初期培养需及时纯化。目前，在将SSCs接种到饲养层前，常采用含有10%胎牛血清的培养基培养细胞悬液，促进体细胞及其他细胞的贴壁生长，应用差异贴壁法可促进SSCs的纯化，但更换培养皿的时间是关键。另外，在SSCs的传代过程中，多采用低速离心(1000 r/min，3 min)甚至不离心，避免离心对细胞造成的损伤。研究显示，低速离心对细胞产生的损伤很小，且离心后吹开再传代的细胞生长状态优于不离心的细胞。

6SSCs的应用前景

SSCs诱导产生精子是治疗男性不育的一个重要途径。目前，所有可能导致男性不育的原因中，70%～90%是源于精子生成障碍。精原细胞在正常的睾丸生精细胞中所占比率很小，不到生精细胞总数的4%，而SSCs就更少，仅占0.02%～0.03%[30]。但在无精症和少精症患者的睾丸细胞中，SSCs浓度通常较正常人高。当男性出现不育但仍有少量精子生成或处于单倍体时期的生殖细胞时,可以采用体外受精、胞质内精子注射和胚胎移植等辅助生殖技术进行治疗。而对于几乎无生精细胞或仅有二倍体细胞存在而导致的精子缺如是无法采用辅助生殖技术进行治疗的。

SSCs诱导产生精子为非梗阻性无精症患者的治疗提供了新途径[31]，一般包括体内诱导和体外诱导。SSCs的移植是体内诱导产生精子的方法，即将外源性SSCs移植到受体睾丸生精小管中，使其诱导产生精子。对于需要接受放化疗的患者,自体SSCs移植具有潜在的应用价值，其不育多是放化疗本身破坏机体正常的内源性精子产生所导致的。因此，患者在接受放化疗前将SSCs取出并进行培养，当治疗后睾丸微环境恢复时再将培养好的SSCs移植回患者体内，但SSCs的自体移植有肿瘤复发的危险。通过干细胞分选技术，在移植前将肿瘤细胞从SSCs悬液中清除出去，可有效避免这种风险[32]。SSCs体外诱导产生精子是科学家的“梦想”。研究初期，由于SSCs分离困难，数量极少，阻碍了体外诱导精子的产生。目前，国内外SSCs培养体系进步明显，可以培养出大量的SSCs，促进了体外诱导精子产生的研究。2001年，Lee等在体外诱导出了新生牛的精子细胞。2012年，Minaee等将小鼠SSCs通过体外诱导，检测出了减数分裂基因的表达。

除了SSCs诱导产生精子，其他干细胞向生殖细胞的诱导实验也已经开始，且已取得了一定成果。据报道，间充质干细胞是脂肪、滑膜、胰腺、外周血、羊水、脐血、胎盘等组织的来源[33]。人脐带间充质干细胞是位于人脐带华通胶间充质干细胞，具有取材方便、来源广泛、数量充足、增殖能力强、长期传代遗传稳定性好等特点[34]，通过诱导，可以分化为骨、软骨、骨骼肌、内皮细胞、心肌细胞及神经细胞等多种细胞，可为临床工作提供来源稳定的组织细胞[35]。因此，有研究将人脐带间充质干细胞在精原细胞培养条件下进行诱导培养，结果证实人脐带间充质干细胞不仅能发生精原细胞样的形态变化及伴发细胞的分化过程，而且能表达精原细胞的特征性标记，提示人脐带间充质干细胞具有向精原细胞方向分化的潜能；另外，将人脐带间充质干细胞移植于不育小鼠睾丸组织细胞中，移植后的间充质干细胞能长期存活并发生移行，且能促进不育小鼠生殖功能的恢复[36]。

干细胞在不育方面的研究引起我们以下思考：①目前认为干细胞主要用于治疗非梗阻性无精症的患者[37]，其适应证还有哪些；②干细胞因子的激动作用和如何准确地进行干细胞诱导定向分化，目前还有待进一步解决[38]。因此，将干细胞相关技术用于治疗男性不育方面的研究刚刚起步，其研究目前仅停留在动物实验的水平上，且由于伦理学以及技术手段的限制，应用于临床尚需一段时间，但随着技术手段的发展和相关科技领域的进步，干细胞的临床治疗必将会给人类的健康带来巨大的医疗价值。

[参考文献]

[1]邱实,田洪阳.基层部队精索静脉曲张发病情况分析[J].解放军医药杂志,2013,25(1):86-88.

[2]宋旭东,唐文君.男性不育与生精细胞凋亡[J].中国综合临床,2006,22(8):733-735.

[3]徐丽,周运恒,李戬,等.男性不育患者解脲脲原体感染与精子质量和抗精子抗体的关系[J].武警医学,2013,24(8):686-690.

[4]Harman J G, Richburg J H. Cisplatin-induced alterations in the functional spermatogonial stem cell pool and niche in C57/BL/6J mice following a clinically relevant multi-cycle exposure[J].Toxicol Lett, 2014,227(2):99-112.

[5]Yoshida S, Sukeno M, Nabeshima Y. A vasculature-associated niche for undifferentiated spermatogonia in the mouse testis[J].Science, 2007,317(5845):1722-1726.

[6]de Rooij D G, Russell L D. All you wanted to know about spermatogonia but were afraid to ask[J].J Androl, 2000,21(6):776-798.

[7]孙大林,张新东.精原干细胞增殖和分化相关因子的研究进展[J].中华男科学杂志,2011,17(3):268-272.

[8]Kanatsu-Shinohara M, Inoue K, Takashima S,etal. Reconstitution of mouse spermatogonial stem cell niches in culture[J].Cell Stem Cell, 2012,11(4):567-578.

[9]Terada L S. Specificity in reactive oxidant signaling: think globally, act locally[J].J Cell Biol, 2006,174(5):615-623.

[10]Menon S G, Goswami P C. A redox cycle within the cell cycle: ring in the old with the new[J].Oncogene, 2007,26(8):1101-1109.

[11]Hu J, Cheng D, Gao X,etal. Vitamin C enhances the in vitro development of porcine pre-implantation embryos by reducing oxidative stress[J].Reprod Domest Anim, 2012,47(6):873-879.

[12]Esteban M A, Wang T, Qin B,etal. Vitamin C enhances the generation of mouse and human induced pluripotent stem cells[J].Cell Stem Cell, 2010,6(1):71-79.

[13]Honaramooz A, Behboodi E, Blash S,etal. Germ cell transplantation in goats[J].Mol Reprod Dev, 2003,64(4):422-428.

[14]Goertz M J, Wu Z, Gallardo T D,etal. Foxo1 is required in mouse spermatogonial stem cells for their maintenance and the initiation of spermatogenesis[J].J Clin Invest, 2011,121(9):3456-3466.

[15]Wang J, Cao H, Xue X,etal. Effect of vitamin C on growth of caprine spermatogonial stem cells in vitro[J].Theriogenology, 2014,81(4):545-555.

[16]Valli H, Sukhwani M, Dovey S L,etal. Fluorescence- and magnetic-activated cell sorting strategies to isolate and enrich human spermatogonial stem cells[J].Fertil Steril, 2014,102(2):566-580.

[17]Hobbs R M, Fagoonee S, Papa A,etal. Functional antagonism between Sall4 and Plzf defines germline progenitors[J].Cell Stem Cell, 2012,10(3):284-298.

[18]Bahadorani M, Hosseini S M, Abedi P,etal. Short-term in-vitro culture of goat enriched spermatogonial stem cells using different serum concentrations[J].J Assist Reprod Genet, 2012,29(1):39-46.

[19]Zhu H, Liu C, Sun J,etal. Effect of GSK-3 inhibitor on the proliferation of multipotent male germ line stem cells (mGSCs) derived from goat testis[J].Theriogenology, 2012,77(9):1939-1950.

[20]Eildermann K, Gromoll J, Behr R. Misleading and reliable markers to differentiate between primate testis-derived multipotent stromal cells and spermatogonia in culture[J].Hum Reprod, 2012,27(6):1754-1767.

[21]张学明,赖良学,李德雪,等.小鼠精原细胞的分离和纯化[J].解剖学报,2000,31(3):235-238.

[22]张卫星,韩广业,王瑞,等.大鼠精原干细胞的分离纯化[J].郑州大学学报(医学版),2009,44(3):497-500.

[23]Kanatsu-Shinohara M, Shinohara T. Spermatogonial stem cell self-renewal and development[J].Annu Rev Cell Dev Biol, 2013,29:163-187.

[24]Oatley J M, Avarbock M R, Telaranta A I,etal. Identifying genes important for spermatogonial stem cell self-renewal and survival[J].Proc Natl Acad Sci U S A, 2006,103(25):9524-9529.

[25]Ryu B Y, Kubota H, Avarbock M R,etal. Conservation of spermatogonial stem cell self-renewal signaling between mouse and rat[J].Proc Natl Acad Sci U S A, 2005,102(40):14302-14307.

[26]申复进,张茨,杨嗣星,等.BALB/c小鼠精原干细胞体外长期培养和鉴定[J].中华男科学杂志,2008,14(11):977-981.

[27]马良宏,邱志军,闫圣男,等.枸杞多糖对精原干细胞体外增殖的影响[J].中国组织工程研究与临床康复,2011,15(23):4277-4281.

[28]霍龙,罗奋华,张岩,等.大鼠精原干细胞的微滴培养法[J].中国细胞生物学学报,2014,5:671-678.

[29]Olive V, Cuzin F. The spermatogonial stem cell: from basic knowledge to transgenic technology[J].Int J Biochem Cell Biol, 2005,37(2):246-250.

[30]Kanatsu-Shinohara M, Miki H, Inoue K,etal. Long-term culture of mouse male germline stem cells under serum-or feeder-free conditions[J].Biol Reprod, 2005,72(4):985-991.

[31]Kubota H, Avarbock M R, Brinster R L. Culture conditions and single growth factors affect fate determination of mouse spermatogonial stem cells[J].Biol Reprod, 2004,71(3):722-731.

[32]Koruji M, Shahverdi A, Janan A,etal. Proliferation of small number of human spermatogonial stem cells obtained from azoospermic patients[J].J Assist Reprod Genet, 2012,29(9):957-967.

[33]Fujita K, Ohta H, Tsujimura A,etal. Transplantation of spermatogonial stem cells isolated from leukemic mice restores fertility without inducing leukemia[J].J Clin Invest, 2005,115(7):1855-1861.

[34]王晓辉,惠玲,杨霄鹏,等.人脐带间充质干细胞体外培养、鉴定及其诱导分化的研究[J].解放军医药杂志,2013,25(10):11-15,30.

[35]崔爽,杨东明.人脐带间充质干细胞治疗急性肾缺血再灌注损伤模型的实验研究[J].临床军医杂志,2013,(2):211-212.

[36]杨雯,惠玲,吕同德,等.人脐带间充质干细胞向血管内皮细胞的定向分化及临床应用进展[J].解放军医药杂志,2013,25(10):26-30.

[37]刘芳,陈必良,苏明权,等.DAZ基因在无、少精症患者血液、精液中的缺失研究[J].武警医学,2004,15(4):515-518.

[38]唐秋灵.人脐带间充质干细胞向男性生殖细胞分化的研究[C].汕头大学,2008.

(收稿时间：2015-05-10修回时间：2015-07-05)

Research Progression of Spermatogonial Stem Cells

WANG Zhen1, ZHANG Bin2, WANG Yang-min2

(1. Department of Urinary Surgery, the Second Hospital of Lanzhou University， Lanzhou 730030, China; 2. Department of Urinary Surgery, Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Area Command, Lanzhou 730050, China)

[Abstract]The stem cells has become the study focus in biomedical field at present， and the study trend has quickly extended from preclinical medicine to clinical application. Stem cells can be classified with somatic stem, pluripotent stem and embryonic stem cells according to its characteristics. Somatic stem cells have obviously advantage in treatment of many diseases in clinic. The spermatogonial stem cells (SSCs) are precursor cells of spermatogenesis, and they have the potentialities of the self duplication and multi-directional differentiation, and are the only somatic stem cells that can pass the genetic information to offspring in male animals. Development of culture and transplantation technology in the SSCs study can not only help the therapy of male infertility patients, but also provide a scientific basis to the development of whole human reproductive medicine.

[Key words]Adult stem cells; Cell culture techniques; Induction; Infertility, male

[文献标志码][中国图书资料分类号]R329.24A

[文章编号]2095-140X(2015)09-0100-05

[通讯作者]王养民，E-mail：13919931420@163.com

[基金项目]全军医药卫生科研基金(CLZ11JB09)；兰州军区攻关课题(LZ13GY01)
[作者单位]730030 兰州，兰州大学第二医院泌尿外科(王振)；730050 兰州，兰州军区兰州总医院泌尿外科(张斌、王养民)