徐小川，姚源，田伟，石锐，陈大福，张秀丽(北京积水潭医院，北京0005；北京市创伤骨科研究所；北京市第六医院)



·基础研究·

新型诱导成骨可降解生物材料增塑淀粉骨埋植的生物安全性观察

徐小川1，姚源1，田伟2，石锐2，陈大福2，张秀丽3(1北京积水潭医院，北京100035；2北京市创伤骨科研究所；3北京市第六医院)

摘要：目的评估新型诱导成骨可降解生物材料增塑淀粉的生物安全性。方法以12只新西兰兔为实验对象，采用自身左右对照的方式在其双侧胫骨平台分别埋植增塑淀粉和S-99可溶性止血纱布。观察4周、8周、12周三个阶段手术区骨组织相容性。结果所有观察期双侧手术区肉眼观察未见充血红肿及骨膜增厚，组织学观察未出现骨吸收及骨破坏。结论增塑淀粉的骨组织相容性较好。

关键词：增塑淀粉；成骨材料；骨埋植；生物相容性评价；兔

海藻酸盐是一种从海洋褐藻中分离出来的天然多糖。由于良好的生物相容性被广泛应用在药物和组织工程等医疗领域，如药物缓控释系统的骨架结构[1]和凝胶状组织工程载体或支架材料[2，3]，但其凝胶在生理环境中容易溶解而失去凝胶特性，此过程难以控制和预测；同时，因其具有较强的亲水性故对蛋白质吸附较差，缺乏细胞特异性作用位点，大量研究着力于海藻酸盐的改性。增塑淀粉是北京化工大学研发的弹性体生物材料，增塑后普通淀粉的强度和弹性大大增加[4]。该材料分子量巨大、缠绕点多、对小分子具有超强包容性，可作为替代海藻酸盐的可降解材料，通过加入骨诱导因子，易成为具有止血及诱导成骨双重作用的组织工程材料[5]。骨埋植试验，是体内试验的一种，即将材料通过外科手术植入到动物的骨组织中，一定时期后通过光学或电子显微镜观察评价材料对活体组织的局部毒性作用，可以观察组织与材料的接触界面以及骨吸收和骨形成情况。依照YY/T 0127.4-1998[6]，2006年1月～2007年10月我们采用自身对照方式对增塑淀粉进行骨埋植试验，观察增塑淀粉的生物安全性。

1材料与方法

1.1材料体质量2.5 kg的健康家兔12只，4周、8周、12周3个试验期各4只。实验部位为家兔双侧胫骨平台。

1.2方法

1.2.1植入物的准备依照YY/T 0127.4—1998标准，实验材料需填装入直径1.5 mm，长5 mm的胶管内。选用临床使用的输液器胶管，制成规定形状，胶管植入前经高温高压消毒。增塑淀粉经钴60照射消毒备用，对照组为S-99可溶性止血纱布(金台牌，北京纺织科学研究所)。

1.2.2手术方法采用自身左右对照方式，一侧埋置实验材料，另一侧为对照材料。全身麻醉后于股骨外侧、胫骨内侧备皮，用浓度为25 g/L的碘酒及75%(V/V)乙醇对术区消毒，逐层切开并分离皮肤、皮下组织、肌肉、骨膜。用齿科低速钻在胫骨平台骨皮质上钻孔，同时用生理盐水冷却。左侧胫骨为实验侧，右侧为对照侧。每侧术区最多制备3个孔，孔间距应>8 mm，孔直径为2 mm，穿透一侧骨皮质达骨髓腔。将充填好材料的胶管指压插入相应预制孔内，逐层缝合肌筋膜、皮下组织及皮肤。

1.2.3指标观察方法

1.2.3.1大体观察于手术后4、8、12周取材，肉眼观察并记录植入体周围组织情况并与对照材料相应区域比较。

1.2.3.2组织学观察相应时间切取包含植入体及其周围组织的组织块，3%甲醛液固定，脱钙，常规系列乙醇脱水，石蜡包埋；垂直植入体长轴进行连续切片，HE染色。记录以下反应指标：①纤维化/纤维性包裹及炎症范围；②组织形貌变化、变性；③从材料/组织界面处观察炎症细胞类型(如多核白细胞、淋巴细胞、浆细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞及多核细胞)、数量及距界面分布的距离；④组织坏死，如细胞核出现碎片和(或)血管壁破裂；⑤材料碎屑、脂肪浸润、肉芽肿；⑥骨与材料接触情况，界面有无非矿化组织存在，有无骨吸收及骨形成。

2结果

2.1大体观察结果实验动物术后活动正常，进食好，伤口一期愈合无伤口感染。4周取材大体标本可见实验侧、对照侧胫骨平台钻孔区附近组织无充血红肿，无骨膜增厚，胶管与骨皮质未结合，胶管内有部分软组织长入。术后8及12周两个阶段实验侧及对照侧胶管与骨组织间可见明显间隙，胶管外覆盖纤维包膜，胶管内容物完全由软组织替代。

2.2组织学观察结果术后4、8、12周所有观察期各视野均未出现骨吸收、骨破坏。4周实验侧与对照侧与骨组织界面清晰，对照侧可见出血细胞(插页Ⅱ图3)，8周时实验侧有炎性反应(插页Ⅱ图4)，12周时实验侧未见异常而对照侧有白细胞(插页Ⅱ图5)。

3讨论

体内植入试验是为了评价活体组织与试验样品材料的相互反应，是评价生物材料生物相容性和安全性的重要体内方法。所有医疗器械和材料植入体内，均会不同程度地产生组织反应。对局部组织的生物学反应评价列出了系列指标，目前，国内常采用的肌肉或皮下局部组织生物学反应评价是根据炎性细胞反应和纤维形成进行组织反应分级，然后再根据组织反应分级情况进行结果评定。对于骨组织植入试验，主要观察组织与材料的接触界面以及骨吸收和骨形成情况。

一般机体对植入物材料的短期反应主要有修复反应、炎性反应和免疫刺激等。材料植入若主要诱发机体修复反应，提示材料的生物相容性和安全性好，反之，若显示炎症、排斥甚至组织坏死，则认为材料的安全性需要提高。本实验对照材料12周组织学观察到白细胞提示该材料安全性还可以进一步完善。

实验观察周期的选择参考ISO10993 《医疗器械生物学评价，第六部分：植入后局部反应试验》[6]和国家行业标准YY/T 0127.4-1998医疗器械标准汇编(口腔材料卷)，第一个文件建议观察期设为1～12周，第二个推荐4～26周。Kolambkar等[7]用大鼠股骨缺损为模型，利用固体支架连接两端在缺损区注入海藻酸水凝胶复合 BMP-2及单纯海藻酸材料，8周后即可进行最大扭矩等力学测试[7]。李平[8]、Priddy等[9]发现，12周时已经可以对生物相容性做出判断。基于上述研究者的工作，本实验没有选择更长的观察时间；但过短时间局部组织尚处于创伤修复期，观察意义不大，因此，未选择1～3周的观察期。

本研究结果表明，增塑淀粉的骨组织相容性符合相应的国家医药行业标准。但是，海藻酸盐、增塑淀粉等材料不易塑形且在体内容易迁散而不能用于恢复需要的骨缺损形态[10]。组织工程可将种子细胞、生长因子和测试材料三要素复合，因此，本材料还需要进一步完善才能在临床使用。

参考文献：

[1] 张强，武凤兰.药剂学——缓释与控释技术[M]. 北京：北京医科大学出版社，2004：505-537.

[2] 顾耕华，何虹，黄剑奇.海藻酸钙膜引导兔颌骨缺损骨再生的对照实验[J].现代口腔医学，2002，16(5):388-390.

[3] 郭全义，卢士璧，张莉，等.藻酸钙凝胶为载体体外短期培养软针细胞的生物学性状[J].中国临床康复，2006，10(1)：61-63.

[4] Lourdin D, Bizot H, Colonna P. “Antiplasticization”in starch-glycerol films[J]. J Applied Polymer Science, 1997,63(8):1047-1053.

[5] 朱爱臣，石锐，陈大福，等.淀粉/聚乙烯醇复合生物膜的制备及其表征[J].中国组织工程研究与临床康复，2010，14(8)：1441-1447.

[6] 中国标准出版社第一编辑室. 医疗器械标准汇编(口腔材料卷)[M].北京:中国标准出版社, 2002:25-27.

[7] Kolambkar YM, Dupont KM, Boerckel JD, et al. An alginate-based hybrid system for growth factor delivery in the functional repair of large bone defects[J]. Biomaterials， 2011，32(1):65-74.

[8] 李平，肖丽英，李伟,等.纳米羟基磷灰石根充糊剂动物根管充填及颌骨和皮下埋植实验[J].实用口腔医学，2007,23(6):793-796.

[9] Priddy LB, Chaudhuri O, Stevens HY， et al. Oxidized alginate hydrogels for bone morphogenetic protein-2 delivery in long bone defects[J]. Acta Biomater, 2014,10(10):4390-4399.

[10] 李宜芬, 姜婷.温敏海藻酸复合凝胶用于非承重区牙槽嵴隧道注射法骨扩增的研究[D].北京:北京大学口腔医学院，2013:9-22.

(收稿日期：2014-06-15)

中图分类号：R318.08

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2015)04-0024-02

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.04.008

通信作者：田伟，E-mail: tianweia@163bj.com

基金项目：北京市自然科学基金重点项目(2061002)。