郭飞翔，陈大卫，石雪晨，赵海晴，伍云，黄嘉棣，顾瑞霞，*（.江苏省乳品生物技术与安全控制重点实验室，扬州大学食品科学与工程学院，江苏扬州57；.广西皇氏甲天下乳业股份有限公司，广西南宁530007）

分离的巴马人群肠道乳酸菌数量及功能性分析

郭飞翔1，陈大卫1，石雪晨1，赵海晴1，伍云2，黄嘉棣2，顾瑞霞1，*
（1.江苏省乳品生物技术与安全控制重点实验室，扬州大学食品科学与工程学院，江苏扬州225127；2.广西皇氏甲天下乳业股份有限公司，广西南宁530007）

摘要：对采集的广西巴马地区长寿家族粪便样品进行菌株分离，通过平板计数，比浊法和平板扩散法对分离的乳酸菌菌群数量、耐受力和抑菌能力分析。结果表明：不同分离培养基之间的菌落总数有差异，并且杆菌选择性培养基菌落数（108cfu/g～109cfu/g）要多于球菌选择性培养基菌落数（107cfu/g～108cfu/g）；不同性别之间分离的女性肠道乳酸菌总数（8.98±0.42）（lg cfu/g）略高于男性（8.87±0.46）（lg cfu/g），不同年龄组中青少年组的肠道乳酸菌数量最多；分离的乳酸菌耐受能力比较发现中年组（0.408 5±0.082 7）（lg cfu/g）与老年组（0.372 6±0.083 2）（lg cfu/g）的耐受胃液能力相当，且显著大于青少年组（0.339 5±0.072 5）（lg cfu/g）和长寿组（0.282 6±0.038 5）（lg cfu/g）；不同年龄组的耐胆盐能力和耐受肠液能力相当；分离的乳酸菌抑菌能力比较发现分离的不同年龄组的乳酸菌抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌能力都是青少年组最强，同一年龄组的乳酸菌抑制大肠杆菌能力较强；分离的男性肠道内的乳酸菌抑制大肠杆菌能力要低于女性，但抑制金黄色葡萄球菌能力相当。

关键词：长寿；肠道；乳酸菌；耐受性；抑菌

广西巴马是世界五大长寿之乡中百岁老人分布率最高的地区，被誉为“世界长寿之乡-中国人瑞圣地”。国际上公认的长寿因素[1-3]有4点：一是基因遗传，二是生活环境，三是饮食习惯，四是社会背景。这4种因素的变化都能够影响人类肠道菌群的改变，而益生菌在肠道菌群均衡中起着重要的作用[4]，它们能够提高肠道对病原菌的抵抗能力，同时预防及早期治疗一些由特定病原菌感染引起的疾病，促进对营养物质的吸收[5]。也有研究表明乳酸菌具有降低胆固醇[6]，辅助治疗肝病[7]，补充微量元素[8-9]，抗氧化[10-11]等功能。本文通过分离巴马人群肠道乳酸菌及对其数量和耐受性、抑菌能力进行分析，旨在建立长寿人群肠道乳酸菌菌种库，并筛选出一批耐受能力及抑菌能力较强的乳酸菌，为食品、药品等行业提供优良菌种；并且比较分析分离的长寿人群肠道菌群数量、乳酸菌耐受性和抑菌能力。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

运输培养基：青岛日水生物技术有限公司；碳酸氢钠，结晶紫，碘片，硫酸镁等：天津市科密欧化学试剂有限公司；鱼粉蛋白胨，石蜡，氢氧化钠，无水乙醇，氯化钙，酵母提取物，葡萄糖，吐温-80，胰胨，番红，甘油等：国药集团化学试剂有限公司；硫酸新霉素，X-Gal，萘啶酸，氯化锂等：购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.2仪器与设备

Bugbox型厌氧工作站：英国Ruskinn公司；H2500R-2型高速冷冻离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司；SX-500型高压灭菌锅：日本TOMY公司；YJ-8755型医用超洁净工作台：苏州净化设备厂；Freezon-18L型冷冻干燥机：美国Labconco公司；BC/BD-216SCN海尔冰柜：青岛海尔集团；可调式封闭电炉：上海跃进医疗仪器厂；HH-6型数显恒温水浴锅：国华电器有限公司；1510型酶标仪：美国Thermo公司。

1.3培养基的制备及溶液的配制

1.3.1培养基

1）MC培养基[12]：大豆蛋白胨5 g，牛肉浸膏5 g，酵母浸膏5 g，葡萄糖20 g，乳糖20 g，碳酸钙10 g，中性红0.01 g，番茄汁200 mL，补充蒸馏水至1 000 mL，调pH至6.0，121℃灭菌15 min，冷却备用；

2）PTYG培养基：胰胨5 g，大豆蛋白胨5 g，多聚蛋白胨3 g，酵母膏10 g，葡萄糖10 g，吐温-80 1 mL，L-半胱氨酸盐酸盐0.5 g，盐溶液40 mL（盐溶液制备：CaCl20.2 g，K2HPO41.0 g，KH2PO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.48 g，NaHCO310 g，NaCl 2 g，蒸馏水1 000 mL，溶解后备用），蒸馏水加至1000mL，调pH至6.8～7.0，121℃灭菌15 min，冷却备用；

3）LCM培养基：胰蛋白胨10 g，酵母浸出汁5 g，胰蛋白3 g，葡萄糖20 g，柠檬酸钠2 g，盐溶液5 mL（盐溶液制备：MgSO4·7H2O 11.5 g，FeSO4·7H2O 1.68 g，MnSO4·2H2O 2.4 g，蒸馏水加至100 mL），K2HPO43 g，KH2PO43 g，半胱氨酸0.20 g，乙酸钠1 g，吐温-80 1 mL，蒸馏水加至1 000 mL，调pH至6.8，121℃灭菌15 min，冷却备用；

4）MRS培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母浸出汁5 g，葡萄糖20 g，吐温-80 1 mL，乙酸钠5 g，柠檬酸二铵2 g，K2HPO42 g，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4· 4H2O 0.25 g，碳酸钙20 g，蒸馏水加至1 000 mL，调pH 至5.6，121℃灭菌15 min，冷却备用；

5）TYC培养基：胰胨15 g，酵母膏5 g，L-胱氨酸0.2 g，乙酸钠20 g，Na2SO40.1 g，NaCl 1 g，Na2HPO4· 12H2O2g，NaHCO32g，蔗糖50g，蒸馏水加至1000mL，调pH至7.3，121℃灭菌15 min，冷却备用；

6）M17培养基：植物蛋白胨5 g，酵母提取物5 g，聚蛋白胨5 g，抗坏血酸0.5 g，牛肉浸膏2.5 g，1.0 mol/L MgSO4·7H2O 1.0 mL，β-甘油磷酸二钠19 g，蒸馏水加至1000mL，调pH至7.1，121℃灭菌15min，冷却备用；

7）SL培养基：酪蛋白水解物10 g，酵母膏5 g，葡萄糖20 g，K2HPO46 g，乙酸钠（3H2O）25 g，柠檬酸二铵2 g，MgSO4·7H2O 0.58 g FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4· 4H2O 0.15 g，吐温80 1.0 mL，蒸馏水加至1 000 mL，调pH至5.4，121℃灭菌15 min，冷却备用；

8）LB培养基：950.0 mL水加胰蛋白胨10.0 g，酵母浸出汁5.0 g，氯化钠10.0 g，加热搅拌均匀溶解后，用氢氧化钠溶液调pH（7.2±0.2）后，补水至1 000 mL，配制固体培养基则在调pH后加入1.5%琼脂，121℃、15 min灭菌备用。

1.3.2人工胃液的配制

量取1 mol/L的盐酸20 mL，加蒸馏水调节pH值至3.0，加入NaCl使其质量分数达到0.2%，然后每100 mL加入1 g胃蛋白酶，充分溶解后用孔径0.22 μm微孔滤膜在无菌操作台中过滤除菌，转入灭菌过的瓶中低温保藏备用[13]。

1.3.3人工肠液的配制

称取KH2PO43.4g，加蒸馏水250mL溶解，用0.4% NaOH溶液调节pH至6.8，加水稀释至500 mL，加入NaCl使其质量分数达到0.2%，每100 mL加入1 g胰蛋白酶，充分溶解后用孔径0.22 μm微孔滤膜在无菌操作台中过滤除菌，转入灭菌过的瓶中低温保藏备用[13]。

1.4样品的采集

样品采集新鲜、一星期内未服用抗生素的长寿村人群的黄软大便，用竹签挑取粪便内部中心粪便样品放入运输培养基中，再加入5 mL灭菌液体石蜡油密封后，迅速置于冰盒内，带回实验室进行微生物菌群分析；采样同时对长寿村人群的饮食习惯进行调查。经统计样品来源中男性23人（1岁～95岁），女性23人（3岁～100岁），采样人群的分布情况如表1所示。

1.5乳酸菌的分离与计数

将带回的样品在无菌操作台上用无菌水稀释至相应稀释度后从试管中取1 mL稀释液，分别接种于灭菌的平板中，倒入先前配好的选择性培养基MRS、PTYG、SL、LCM、TYC、M17、MC放入厌氧工作站中37℃培养48 h，根据平板上的活菌数和稀释度，选取菌落数在30 cfu/g～300 cfu/g之间的平板计算出活菌数。

1.6乳酸菌的初步鉴定

对分离到的乳酸菌进行革兰氏染色，于显微镜下观察菌体形态，并进行运动性及产气、过氧化氢酶、产酸等生理生化鉴定[12]。

1.7乳酸菌耐胆盐能力的测定

将活化两代的菌种按5%接种量接种到富含0.5%牛胆盐的MRS培养基中，37℃培养4 h，分别测定培养0、4 h培养基OD620nm值[14]，以未接种乳酸菌的富含牛胆盐的培养基为空白对照，按下面公式计算：

1.8乳酸菌对人工胃液耐受能力的测定

将活化两代的菌种按5%接种量接种到pH为3的人工胃液中，37℃培养4 h，分别测定培养0、4 h人工胃液OD620nm值[15-16]，以未接种乳酸菌的人工胃液为空白对照，按下面公式计算：

1.9乳酸菌对人工肠液耐受能力的测定

将活化两代的菌种按5%接种量接种到人工肠液中，37℃培养4 h，分别测定培养0、4 h人工肠液OD620nm值[17]，以未接种乳酸菌的人工肠液为空白对照，按下面公式计算：

1.10乳酸菌对致病菌的抑制作用

将LB培养基倒入平板中，冷凝后加入0.1 mL菌液浓度为108cfu/mL的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌，涂抹均匀放置1 h后打孔，孔径10 mm，孔深3 mm，将乳酸菌发酵液注入孔内，于37℃倒置培养10 h后测量抑菌圈大小[18-19]。

1.11数据处理

用SPSS 19.0统计软件对数据进行分析。

2　结果与分析

2.1肠道乳酸菌的分离及分析

用6种培养基对46份粪便样品进行菌株分离并计数，共分离获得2076株菌株，经生理生化鉴定将1823株菌株初步确定为乳酸菌；不同分离培养基平均菌落总数见图1。

由图1可知，同一人群不同培养基来源之间的菌落总数存在显著性差异，其中PTYG为双歧杆菌选择性培养基，其菌落总数在109cfu/g左右，而双岐杆菌是健康人体的优势菌群，数量一般在109cfu/g以上，但由于粪便样品脱离肠道，暴露于空气中后部分失活，所以最终计数结果在109cfu/g左右；SL、LCM为乳杆菌选择性培养基，其菌落总数在108cfu/g～109cfu/g；TYC、M17为肠球菌选择性培养基，其菌落总数在107cfu/g～108cfu/g；而MRS培养基并没有较强的选择性，杆菌球菌能够生长，所以其菌落总数在109cfu/g以上。这说明分离的健康人群体内的杆菌数要比球菌数要多，杆菌中尤其是双岐杆菌对人类健康有着非常重要的作用[20]。

2.2分离的不同人群肠道乳酸菌总数的比较

通过对计数培养基MC平板上的菌落进行计数，结果见表2。

由表2可知，分离的人群中女性肠道乳酸菌总数略高于男性，但是差异性不显著；青少年组的肠道乳酸菌数量最多，随着年龄的增长，乳酸菌数量逐渐减少，但是长寿组乳酸菌数量还是保持着一个很高的水平，与中年组及青年组水平相当，说明长寿老人仍保持着一个健康的肠道菌群平衡。

2.3分离的肠道乳酸菌的耐受能力的比较

通过比色法对分离的菌株进行耐受性实验，结果见表3。

由表3可知，中年组与老年组的菌株耐受胃液能力相当，且显著大于青少年组和长寿组，其中长寿组菌株耐受胃液能力最差；不同年龄各组的菌株耐胆盐能力和耐受肠液能力相当，并无显著性差异；不同性别组的菌株耐受能力都无显著性差异；对菌株不同的耐受能力的参数分析发现分离的乳酸菌对胃液耐受能力显著高于对胆盐和肠液的耐受能力。

2.4分离的不同年龄人群肠道乳酸菌对致病菌的抑制作用

通过单层琼脂平板扩散法，探讨了分离菌株对致病菌的抑制能力，结果见图2。

由图2可知，分离的不同年龄组的乳酸菌抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌能力都是青少年组>中年组>长寿组>老年组，其中中年组要显著强于老年组；分离的同一组别的乳酸菌抑制大肠杆菌能力要强于抑制金黄色葡萄球菌能力；分离的男性肠道内的乳酸菌抑制大肠杆菌能力要低于女性，但抑制金黄色葡萄球菌能力相当。

3　结论与讨论

1）通过对巴马人群饮食调查发现，其饮食结构是低能量、低脂肪、低盐、低胆固醇饮食。人们每天早晚喜欢喝粥，中午吃米饭和玉米，不酗酒；他们喜欢食用天然、绿色食品如吃的是青菜、果菜、野菜以及巴马当地盛产的火麻仁，其中火麻仁富含不饱和脂肪酸、蛋白质、卵磷脂、油酸、亚麻酸等，是唯一能溶于水的植物油，还含有人体所需的多种营养成分。而且，这些菜大都是煮着吃，很少炒；喝的是纯天然的山泉水，水质好。

2）通过对分离的巴马人群不同培养基来源的乳酸菌菌群数量比较，发现分离的杆菌数要多于球菌数，女性肠道乳酸菌总数略高于男性，青少年组的肠道乳酸菌数量最多，随着年龄的增长，乳酸菌数量逐渐减少，但是长寿组乳酸菌数量还是保持着一个很高的水平；对其耐受能力比较发现它们的耐受能力都不是很高，可能是由于体外培养条件与体内有较大的差异，在肠道中有很多微生物共生，而且厌氧，而由于条件的限制无法完全做到；乳酸菌对胃液耐受能力高于对胆盐和肠液的耐受能力，可能是因为本身代谢可产生大量乳酸，因而对酸不敏感；对其抑制致病菌能力比较发现抑菌能力随着年龄增长逐渐减弱，但是长寿老

人体内乳酸菌抑菌能力仍比较强，分离的男性肠道内的乳酸菌抑制大肠杆菌能力要低于女性，但抑制金黄色葡萄球菌能力相当。

3）由于试验的菌株数较多，只能对运用比色法对其耐受能力进行初步测定，想要筛选出大量的优良菌种还需用平板计数法对其耐受、抑菌能力以及其他功能特性进一步研究。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.24.043

收稿日期：2014-07-15

基金项目：江苏高校优势学科建设工程项目；“十一五”国家科技支撑计划项目（2013BAD18B12）；江苏省科技支撑项目（BE2011383）；江苏省高校自然科学研究重大项目（12KJA550003）

作者简介：郭飞翔（1990—），男（汉），在读硕士研究生，研究方向：乳品科学。

*通信作者：顾瑞霞（1963—），男（汉），教授，博士，研究方向：乳品科学。

Analyze the Amount of Lactic Acid Bacteria from Population of Bama and Their Function

GUO Fei-xiang1，CHEN Da-wei1，SHI Xue-chen1，ZHAO Hai-qing1，WU Yun2，HUANG Jia-di2，GU Rui-xia1，*
（1.Jiangsu Province Key Laboratory of Dairy Biological Technology and Safety Control，College of Food Science and Engineering，Yangzhou University，Yangzhou 225127，Jiangsu，China；2.Guangxi Huangshi Jiatianxia Dairy Co.，Ltd.，Nanning 530007，Guangxi，China）

Abstract：Collect the stool specimens from longevity village population of Bama for separating strain and analyzing the amount of them and capacity of tolerance and inhibition by plate colony-counting，turbidimetry，plate diffusion.The results showed that：the amount of colony between different isolation medium had difference，and the amount of bacillus（108cfu/g-109cfu/g）was more than coccus（107cfu/g-108cfu/g）；the amount of colony from female（8.98±0.42）（lg cfu/g）was more than male（8.87±0.46）（lg cfu/g），youth group had was the most among age groups；the capacity of tolerating gastric juice of middle age group（0.408 5±0.082 7）（lg cfu/g）and old age group（0.372 6±0.083 2）（lg cfu/g）were similar，and theirs were significantly higher than youth（0.339 5±0.072 5）（lg cfu/g）and longevity group（0.282 6±0.038 5）（lg cfu/g）；capacity of tolerating bile and intestinal juice between age groups had no significant difference；the youth group had the strongest inhibitory effect on E.coil and Staphylococcus aureus among age groups，and the strains had stronger inhibitory effect on E.coil than Staphylococcus aureus；the strain from male had lower inhibitory effect on E.coil than female，but had no significant difference on Staphylococcus aureus.

Key words：longevity；intestinal；lactic acid bacteria；capacity of tolerance；inhibition