结核分枝杆菌耐药突变检测的临床研究

朱蔚岗, 周稳兰, 李军, 花心萍, 曹素珍, 卢应梅, 纪晓燕

(江苏省泰州市第二人民医院 感染病科, 江苏 泰州, 225599)

关键词:结核分枝杆菌; 抗结核药物; 耐药性

近年来，中国的结核病发病率和耐药率均有上升趋势，每年有将近12万新发耐多药结核病患者，未来数年内可能出现耐药菌为主的流行态势[1]。耐药结核病常规的疫情监测不仅是临床用药和评价化疗方案的重要依据,也是流行病学和结核病控制工作的重要指标[2]。如何快速、准确检测结核分枝杆菌对主要一线药物的耐药性具有重要的临床意义。据报道异烟肼耐药与过氧化氢酶-过氧化物酶的编码基因KatG有关[3], 同时还有研究[4]证实了结核分枝杆菌耐利福平与RNA聚合酶的β亚基的编码基因rPOB 的突变有关。本研究检测结核分枝杆菌复合体对利福平、异烟肼、乙胺丁醇、链霉素的耐受性，现报告如下。

1资料与方法

1.1一般资料

分析本院2012年6月—2014年6月诊治肺结核患者，选择其中痰涂片结核分枝杆菌阳性164株，提取痰液中涂阳标本进行检测。

1.2方法

检测方法为PCR-反向点杂交法，采用实时荧光聚合酶链式扩增和熔解曲线分析技术对痰液涂片阳性标本中结核分枝杆菌(MTB)耐药基因进行检测，分别对特定药物：利福平突变位点rpoB507-533; 异烟肼突变位点KatG315, inhA启动子, inhA94, ahpC启动子；乙胺丁醇突变位点em6B306, 368, 378, 380, 406, 497; 链霉素突变位点rrs512环, 904环, rpsL43,88进行检测，技术及报告由深圳亚能医学检验所提供，通过检测突变位点，诊断筛查出耐药结核患者。

1.3耐药判定标准

单耐药，对一种抗结核药物耐药；多耐药，对一种以上抗结核药物耐药，但不包括同时对异烟肼和利福平耐药；耐多药，至少同时对异烟肼和利福平耐药；广泛耐药，对异烟肼和利福平耐药外，同时还对乙胺丁醇和链霉素耐药。

2结果

2.1菌株总的耐药分布

对164株结核分枝杆菌进行抗结核药耐药性测定，其中有41株结核分枝杆菌耐药，总耐药率为25%。四种抗结核药物的耐药率分别是：耐异烟肼31株(75.6%), 耐利福平27株(65.9%), 耐乙胺丁醇13株(31.7%), 耐链霉素19株(46.3%)。

2.2耐药情况统计

41株耐药结核分枝杆菌中，耐1药12例(29.3%)，耐2药13例(31.7%)，耐3药12例(29.3%)，耐4药4例(9.8%)。其中4种抗结核药物中耐药情况分别为: ① 耐单药共12例(7.3%): H耐药6株，耐药率14.6%; R耐药4株，耐药率9.8%; S耐药2株，耐药率4.9%; ② 多耐药共10例(6.1%): H+S耐药6株，耐药率14.6%; R+E耐药1株，耐药率2.4%; R+S耐药2株，耐药率4.9%; R+E+S耐药1株，耐药率2.4%; ③ 耐多药共15例(9.1%): H+R+E耐药7株，耐药率17.1%; H+R+S耐药4株，耐药率9.8%; H+R耐药4株，耐药率9.8%; ④ 广泛耐药共4例(2.4%): H+R+E+S耐药4株，耐药率9.8%。164株结核分枝杆菌中总耐多药率为11.6%(19/164), 其中广泛耐药结核(XDR-TB)占耐多药结核(MDR-TB)病例达21.1%(4/19)。

3讨论

近年来结核病疫情呈现上升的趋势，由于抗结核药物的不规范治疗，患者体内的结核杆菌对多种抗结核药物发生耐药，从而形成耐多药结核病，这是结核病疫情重新上升的最主要原因之一[5]。结核分枝杆菌及其耐药性的快速鉴定对结核病早期治疗和控制耐药菌的传播具有重要的意义。

本研究通过PCR-反向点杂交法技术，对痰涂片结核分枝杆菌阳性164株菌进行检测，结果显示结核分支杆菌耐药率为25%(41/164)，其中对异烟肼、利福平两种以上抗结核药物耐药(耐多药)率为11.6%(19/164)。而2000年进行的第4次全国结核流行病学调查结果显示，中国结核病耐药率为27.8%，耐多药率为10.7%[6]。上述数据比较说明该检测方法的可行性及准确性。从耐多药比值看，本组数据比例稍高，也说明了近几年来耐多药结核有所增加。从耐药情况分析看，耐药株对4种抗结核药物的单药耐药率分别为：耐异烟肼75.6%，耐利福平65.9%，耐链霉素46.3%，耐乙胺丁醇31.7%；耐药顺序为：H>R>S>E，其中耐2、3、4种一线抗结核药物明显增高，导致多耐药、耐多药、广泛耐药患者比例增高，特别是本地区广泛耐药结核(XDR-TB)占耐多药结核(MDR-TB)达21.1%, 与研究[7]报道北京地区2002—2005年发现13例广泛耐药结核病例，占同期耐多药结核病例的6.28%的结果要明显增多。

广泛耐药结核病(XDR-TB)产生的原因主要是由于结核病控制措施的薄弱和不足、二线抗结核药物使用不当。有研究[8]表明, XDR-TB的形成与先前抗结核的药物总共服用时间及选用的二线抗结核药物的种类关系密切；其他新近的抗结核药物研究和临床应用较延迟且价格不菲，不能广泛地应用于临床并及时治愈耐药结核病，从而耐药程度越来越重，最终形成对抗结核药物的广泛耐药。因此，做好预防工作，尽量减少发展为耐药结核病的概率，临床上尽早行药物敏感性试验，选择敏感药物治疗，加快抗结核新药的研发，使结核病患者在最短时间内治愈，以防发展成为耐药结核病。这些数据反映了本地区结核病患者结核分枝杆菌的耐药现状，也是造成本地区肺结核难治的重要原因之一。

中国肺结核复治患者的耐药率大部分地区在60%以上，属高复治耐药病例的国家[9], 而发达国家低于30%,多种耐药率高。自RFP、EMB等应用以后，复治病例的耐药率由耐1、2种药物变为耐3、4种药物，甚至有耐药7、8种的病例[10]。引起结核分枝杆菌产生耐药性的外部因素主要为不规则治疗，内部因素为耐药基因的产生与突变，在单株结核分枝杆菌中可同时有几种耐药基因的突变，进而引起多耐药菌株的产生。耐药基因的检测更能反映细菌在体内对抗菌药物的作用结果，因此加强对结核分枝杆菌的耐药基因的检测有重要的临床价值[11]。一直以来，结核病诊断的标准方法主要包括分枝杆菌分离培养、抗酸菌痰涂片镜检、菌种鉴定和药敏试验等，但是其普遍存在特异性差、灵敏度低或需时长等缺点。本研究采用方法与传统结核菌培养和药敏检测方法相比具有时间短、数小时内可完成等特点，检测结核分枝杆菌对异烟肼、利福平、链霉素、乙胺丁醇等4种主要一线抗结核药物的耐药性，具有较高的特异性和敏感性，能够快速诊断并筛查出耐药结核患者，从而为患者尽快提供有效的诊疗方案。

参考文献

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基金项目:江苏省泰州市科技支撑社会发展计划项目(泰科2013-156-188)

收稿日期:2014-11-07

中图分类号:R 378.91

文献标志码:A

文章编号:1672-2353(2015)03-110-02

DOI:10.7619/jcmp.201503034