王宇晴，姚汝强，张云山(天津市中心妇产科医院，天津300100)

多能干细胞体外定向分化生殖细胞的研究进展

王宇晴，姚汝强，张云山
(天津市中心妇产科医院，天津300100)

摘要:生殖细胞缺失造成的不孕不育目前尚无治愈手段。胚胎干细胞(ESCs)和诱导多能干细胞(iPSCs)体外定向分化研究的进步为体外生成生殖细胞提供了新途径。胚胎干细胞和诱导多能干细胞经由外胚层样细胞(Epi-LCs)能被诱导成为原始生殖细胞样细胞(PGCLCs)。这些原始生殖细胞样细胞具有正常的生精/卵以及繁殖功能。现将小鼠及人类ESCs和iPSCs向生殖细胞分化的研究进行综述，为解决生精/卵障碍的不孕问题提供新的思路。

关键词:不孕不育症;胚胎干细胞;诱导多能干细胞;原始生殖细胞样细胞

生殖细胞的一个重要特点是能够进行减数分裂并生成单倍体配子，从而使其遗传物质减半。配子质量较差或较少是导致不孕不育的主要原因。辅助生殖技术为不孕不育患者带来了希望，但体外受精技术也要求提供有效的生殖细胞即配子。因此对无功能性生殖细胞的男性或女性来说，在体外培养出配子将是克服不孕不育的一个新途径。人类的多能干细胞，包括胚胎干细胞(ESCs)和诱导多能干细胞(iPSCs)能够提供体外研究生殖细胞发育的模型。已有文献报道，小鼠以及人类ESCs和iPSCs在体外培养条件下可向生殖细胞分化，一些小鼠胚胎干细胞定向分化形成的成熟单倍体精子细胞具有使卵子受精并产生活的后代的能力［1］。现将ESCs和iPSCs向生殖细胞分化的研究现状综述如下。

1　多能干细胞向生殖细胞的定向分化

1.1多能干细胞的特点多能干细胞具有两个基本特点:一是自我更新，即能够在增殖的同时保持分化潜能;二是全能性，即能够分化为原肠腔三个胚层所有的细胞类型。多能干细胞能够分化为生殖细胞系。源于胚胎细胞的人胚胎干细胞(hESCs)以及源于原始生殖细胞(PGCs)的人胚胎生殖细胞(hEGCs)最初发现于1998年［2］。此后人们便开始尝试重新编程体细胞以得到体外iPSCs。2006年，Takahashi等首次通过将慢病毒介导的四个转录因子Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc转入小鼠纤维原细胞，获得小鼠诱导多能干细胞(miPSCs)［3］。2007年，人们通过将转录因子Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc或Oct3/4、Sox2、Nanog由慢病毒介导转入人纤维原细胞，获得人诱导多能干细胞(hiPSCs)［4］。研究发现，经重新编程获得的hiPSCs与hESCs一样，能够在体外定向分化为早期PGCs。不管是在体内还是体外，二者的细胞形态、生长条件、增殖、基因表达以及分化为三个胚层细胞的能力方面都非常相似［5］。使用iPSCs代替ESCs不仅能克服一些伦理方面的问题，还能实现基因个体化。

1.2ESCs及iPSCs的定向分化能力

1.2.1ESCs向PGCs的定向分化研究人员发现小鼠胚胎干细胞(mESCs)在体外培养的条件下能够定向分化为雌性生殖细胞的前体，并能进行减数分裂，形成滤泡样结构［6］。将mESCs与M15细胞(可分泌BMP4)混合进行三维培养，随后分离mESCs并与性腺基质细胞共培养，移植入雄性小鼠睾丸包膜下，移植的生殖细胞表现出植入到输精小管样管腔中的趋势，并有一部分细胞产生了正常形态的精子［7］。人胚胎干细胞也能够在体外培养的特定条件下向生殖细胞分化，并表达生殖细胞特异RNA和蛋白因子如VASA、SCP3［8］。去除饲养细胞以及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等促进细胞自我更新的因子之后，hESCs能够自发分化为人原始生殖细胞(hPGCs)，不过频率较低。在培养基中添加骨形成蛋白家族BMP-4、-7和-8b，延长培养时间，与人类或小鼠胚胎性腺基质细胞共培养，均能够提高hESCs向PGCs分化的概率。此外，与人类胚胎性腺基质细胞、小鼠睾丸支持细胞、小鼠胚胎成纤维细胞或猪卵巢成纤维细胞共培养也能够提高hESCs/iPSCs定向分化为原始生殖细胞样细胞(PGCLCs)的概率［9］。

深入研究发现，hESCs/iPSCs经由EpiLCs进一步定向分化为PGCLCs。研究者在无血清、无饲养细胞的条件下，在2个抑制因子MAPK inhibitor和GSK3 inhibitor及LIF的持续刺激下，将mESCs诱导成为EpiLCs［10］。EpiLCs向生殖细胞的进一步分化需要激活素A(ActA)和bFGF的参与，并需要添加1%的血清替代品。研究发现，只有诱导2 d的Epi-LCs能够大量分化为mPGC，而mESCs和诱导1、3 d 的EpiLCs不能够分化为mPGC。Wnt3对于PGC的分化也是必要的，EpiLCs表达Wnt3的水平与外胚层细胞一致，证明其分化为PGC的能力［11］。在诱导生成PGCLCs的过程中，大部分诱导2 d的Epi-LCs具有分化为生殖细胞的潜能，但其中仅约40%的细胞获得足量Blimp1(调节PGC生成的关键性转录调节因子)并分化为PGCLCs，可能有一些随机的、物理的或内在的差异导致约60%的EpiLCs没有进一步发育为生殖细胞［10］。

1.2.2iPSCs向PGCs的定向分化hiPSCs能够定向分化为生殖细胞，而且几乎与hESCs分化为生殖细胞的潜能相同。BMP4能促进来源于胚胎或成人的hiPSCs细胞向PGCLCs细胞分化，作用方式与ESCs类似［12］。随后研究者成功诱导了其他组织来源的hiPSCs得到经减数分裂后的单倍体细胞［13］。与ESCs相似，通过过表达DAZL和VASA来诱导由hiPSCs分化生成的PGCLCs进行减数分裂［14］。然而与hESCs相比，iPSCs中的内源性和外源性多能标志因子的表达水平非常高，直至分化至14 d后二者才下降到同一水平［5］。已分化的hESCs和iPSCs的生殖细胞标志因子的mRNA表达水平相当。但是iPSCs分化为生殖细胞的数目较ESCs多［6］。

2　ESCs及iPSCs体外诱导生成的PGCs的发育

目前，体外分化生成的生殖细胞能否通过减数分裂产生具有功能的配子还是一项挑战。减数分离第一期包括联会复合物(SC)形成、同源染色体配对、同源基因在交叉点重组等。采用针对SC特异蛋白进行免疫荧光技术可鉴别减数分裂的不同阶段，并通过FACS技术检测单倍体配子是否形成。2004年，Geijsen等［15］利用拟胚体将mESCs分化成的SSEA/OCT4(生殖细胞标志因子)阳性细胞分离，并在RA刺激下成功诱导了减数分裂，产生的单倍体细胞具有与成熟精子相同的表型及特异基因-Igf2r和H19。然后采用卵胞浆内单精子注射技术(ICSI)证实了它们的功能。其他研究人员用不同的方法得到了同样的结果［16，17］。但这些研究也暴露了体外生成配子存在的一些问题，尤其是在减数分裂和生殖细胞的成熟方面。

2006年，Novak等［18］将2个与雄性生殖细胞标志物Stra8和Prmt1关联的报告基因转入mESCs中，建立了精原干细胞，培养基中加入RA后诱导精原干细胞进入减数分裂并形成拟胚体，这些细胞能表达减数分裂期间和分裂后标志物，证实体外生成了PGCLCs。然而把这些PGCLCs产生的精子植入被绝育小鼠的睾丸中，发现它们活力有限;通过ICSI将它们注入卵母细胞后产生了后代，证明它们是有功能的。但几乎所有的幼崽都表现出表型的改变，如生长发育迟缓、过早死亡等。这可能是因为由mESCs分化而来的生殖细胞难以建立一个生殖细胞印记，从而导致异常甲基化［19］。

转录后调控在生殖细胞进入减数分裂的过程中起重要作用。在性腺基质缺乏的情况下，高度保守的RNA结合蛋白的基因修饰可引起生殖细胞进入减数分裂进程;体外自发生成的生殖细胞经过纯化之后，在随机加入的生长因子调控下也能够完成减数分裂过程［20］。但以上研究中单倍体细胞的形成效率都非常低，有待进一步提高。

2011年研究者首次报道了由雄性小鼠诱导产生的iPSCs分化为EpiLCs，进而生成PGCLCs并进入减数分裂进程的研究结果［10］。次年该研究小组报道了由雌性mESCs诱导产生的PGCLCs发育为卵母细胞进而产生后代的研究成果［1］。由PGCLCs诱导产生后代的几率低于PGCs和野生型卵母细胞。大部分由PGCLCs诱导产生的卵母细胞的减数第一次分裂过程是正常的，而约一半的PGCLC衍生的卵母细胞未能分离出第二极体，其机制有待进一步研究。最新的研究通过构建易于操控的试验模型，发现CD38糖蛋白是hPGCLC的表面标记物。SOX17基因能够调节BLIMP1，使其抑制形成hPGCLC过程中内胚层和其他体细胞基因的表达，是hPGCLC形成的关键因子。而人类和小鼠PGCs分化的巨大不同很可能是由于二者截然不同的胚胎发育模式和不同的细胞多能性造成的。

3　展望

尽管研究者获得具有个体特异性的iPSCs的组织和细胞类型日益广泛，方法也日益改进，但仍然没有一种统一、高效、安全、方便的建立iPSCs细胞系的方法。不管是ESCs和iPSCs体外定向分化为PGCLCs，还是PGCLCs进入减数分裂产生单倍体配子，这些过程的发生概率都非常低，且新生后代的健康状况无法预测和控制。另外，由于小鼠和人类PGCLCs的诱导生成原理存在巨大差异，即使利用小鼠PGCLCs能够生成功能配子并产生后代，但要将该技术应用于人类，还需要更多更完善的研究。

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［20］Eguizabal C，Montserrat N，Vassena R，et al.Complete meiosis from human induced pluripotent stem cells［J］.Stem Cells，2011，29(8) : 1186-1195.

·经验交流·

(收稿日期:2015-01-05)

通信作者:张云山

文章编号:1002-266X(2015)18-0104-03

文献标志码:B

中图分类号:R711

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.18.041