赵严冬，王建(徐州医学院第二附属医院，江苏徐州221004)

IL-17对乳腺癌细胞侵袭力的影响及机制

赵严冬，王建
(徐州医学院第二附属医院，江苏徐州221004)

摘要:目的探讨IL-17对人乳腺癌细胞侵袭能力的影响及其可能机制。方法选择对数生长期乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231，分别加入含浓度为1、10、100 ng/mL的IL-17的培养液进行干预处理(处理组)，将不含IL-17培养液处理的细胞作为空白对照组。采用CCK-8实验检测细胞增殖能力，Transwell小室实验检测细胞穿透能力，Western blot检测乳腺癌细胞中磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达。结果100 ng/mL的IL-17作用72 h可明显抑制MCF-7增殖，10、100 ng/mL IL-17分别作用48 h和72 h可明显抑制MDA-MB-231增殖。与空白对照组比较，各处理组MCF-7和MDA-MB-231穿膜数明显增加，p-ERK、MMP-9表达水平明显升高(P均＜0.05)，且其表达呈浓度依赖性。结论IL-17能促进人乳腺癌细胞的侵袭，其机制可能与上调人乳腺癌细胞中p-ERK和MMP-9表达有关。

关键词:白细胞介素17;乳腺癌;磷酸化细胞外信号调节激酶;基质金属蛋白酶-9

乳腺癌的发生发展是多基因、多因素共同参与的复杂过程。感染因素在部分乳腺癌的发生发展过程中起重要作用，约20%的乳腺癌归因于病毒感染，如EB病毒和人乳头瘤病毒(HPV)［1，2］。乳腺癌作为一个炎症相关性肿瘤，其发生发展可能与炎症因子IL-17有关［3］。2013年12月～2014年10月，我们观察了IL-17对人乳腺癌细胞侵袭转移的影响，并对细胞中基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK)表达进行检测。现报告如下。

1　材料与方法

1.1材料人乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231，由徐州医学院肿瘤实验室保存传代。胎牛血清(杭州四季青)，DMEM培养基(美国Hyclone公司)，L15培养基(南京凯基)，Metrigel基质凝胶(美国BD公司)，Transwell(美国Millipore公司)，IL-17(美国Peprotech公司)，ERK、p-ERK抗体(美国Cell Signaling公司)，MMP-9抗体(武汉博士德)。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养将MCF-7、MDA-MB-231接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基和L15培养基中(加入青霉素、链霉素各100 U/mL)，置37℃、5% CO2培养箱中培养(MDA-MB-231使用无孔培养瓶培养)，以0.25%胰蛋白酶消化传代。

1.2.2细胞增殖能力检测采用细胞增殖—毒性检测法。取对数生长期细胞，加入胰蛋白酶消化、离心，用高糖DMEM培养基将MCF-7调整为3×104/mL，用L15培养基将MDA-MB-231调整为4×104/mL，分别接种于96孔板，置37℃、5% CO2培养箱中培养24 h;弃培养基，分别加入1、10、100 ng/mL 的IL-7(处理组)，每个浓度设5个复孔;空白对照组加入等量培养液，分别培养24、48、72 h。弃培养液，加入新鲜培养液及CCK-8试剂，37℃、5% CO2培养箱孵育3 h，上酶标仪于波长450 nm处测量OD值。以上步骤重复3次，取平均值。

1.2.3细胞侵袭能力检测采用Transwell试验。取MCF-7和MDA-MB-231加入培养基，分别制成2.5×105和3.5×105/mL的单细胞悬液。向Transwell小室的上室中加入无血清培养基(空白对照组)以及1、10、100 ng/mL IL-7处理过的细胞各200 μL，下室中加入含10%胎牛血清的培养基400 μL，37℃、5% CO2培养箱中培养24 h，95%甲醛固定10 min，PBS冲洗，结晶紫染色，双蒸水冲洗，用棉签轻轻擦去上室内表面的细胞，200倍光镜下随机选择5个视野，计数穿过人工基底膜的细胞数。实验重复3次，取平均值。

1.2.4ERK、p-ERK、MMP-9检测采用Western blot法。收集空白对照组和分别含1、10、100 ng/mL浓度IL-17的培养液处理24 h的细胞，提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，使用SDS-PAGE蛋白电泳，半干转膜，常规封闭2 h，一抗(ERK、p-ERK浓度1∶1 000，MMP-9浓度1∶100) 4℃孵育过夜，二抗(1∶1 000)孵育2 h，将聚偏氟乙烯膜放入Washing buffer洗涤，再用ddH2O清洗，加入显色液，ddH2O终止显色，观察、拍照，凝胶图像分析系统读取条带灰度值。

1.3统计学方法采用SPSS16.0统计软件，计量资料以珋x±s表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组细胞增殖能力MCF-7各处理组中，100 ng/mL IL-17作用72 h后细胞增殖明显受到抑制; MDA-MB-231各处理组中，10、100 ng/mL IL-17作用48 h和72 h后细胞增殖明显受到抑制。见表1。

表1　各组细胞增殖能力比较(n=15，OD值，±s)

注:与空白对照组比较，*P＜0.05;与同浓度24 h比较，#P＜0.05。

组别MCF-7 24 h　48 h　72 h MDA-MB-231 24 h　48 h　72 h空白对照组　0.86±0.16　1.09±0.13　1.31±0.11　0.89±0.04　0.77±0.03　0.92±0.04 IL-17处理组1 ng/mL　0.90±0.99　1.13±0.95#　1.30±0.03#　0.87±0.06　0.77±0.04　0.88±0.04 10 ng/mL　0.93±0.11　1.09±0.10#　1.24±0.11#　0.87±0.05　0.68±0.04* #　0.79±0.04* #100 ng/mL　0.98±0.10　1.08±0.10　0.98±0.07*　0.86±0.05#　0.61±0.03* #　0.73±0.02*#

2.2各组细胞侵袭能力见表2。

表2　各组穿膜细胞数比较(n=9，±s)

注:与空白对照组比较，*P＜0.05;与1 ng/mL比较，#P＜0.05; 与10 ng/mL比较，ΔP＜0.05。

组别　穿膜细胞数(个) MCF-7　MDA-MB-231空白对照组7.67±1.53　21.33±1.53 IL-17处理组1 ng/mL　23.67±1.56*　56.67±2.08*10 ng/mL　38.33±2.31* #　102.33±14.57* #100 ng/mL　58.33±4.73* #Δ　139.00±16.70* #Δ

2.3各组ERK、P-ERK、MMP-9表达水平IL-17各处理组和空白对照组比较，ERK蛋白相对表达量无明显变化，p-ERK、MMP-9蛋白相对表达量增加。提示IL-17可以促进细胞中的p-ERK、MMP-9的表达。见表3。

3　讨论

IL-17主要由CD+4T细胞亚群Th17细胞产生，能够与许多细胞表面的IL-17受体结合，诱导细胞分泌大量炎症细胞因子和趋化因子，进而将中性粒细胞招募至炎症部位，参与中性粒细胞介导的炎症反应［4］。IL-17为促炎性细胞因子，与炎症发展、免疫应答、免疫排斥等多种生物学活动有关，许多肿瘤组织如卵巢癌、乳腺癌、结直肠癌、非小细胞肺癌、前列腺癌等组织中均存在IL-17 mRNA高表达［5～7］。侯倩男等［8］报道，IL-17作用于子宫内膜癌细胞，可增加其侵袭力。本研究显示，IL-17作用于MCF-7、MDA-MB-231后，不同浓度IL-17处理组的穿膜细胞数均较空白对照组明显增多，提示IL-17具有增强乳腺癌细胞侵袭转移能力的作用。

MAPK是细胞内重要的信号传递者，参与多种生理过程的调节。IL-17可以激活NF-κB和MAPK通路，通过NF-κB和MAPK发挥其促炎症作用［9］。研究表明，ERK调控异常与多种恶性肿瘤的发生、转移密切相关，ERK、p-ERK在乳腺癌细胞中的表达均明显高于正常乳腺上皮细胞，提示ERK蛋白过度表达和异常活性可能在乳腺癌中发挥重要作用。本研究显示，空白对照组和处理组细胞均有ERK和p-ERK蛋白表达，组间ERK表达无统计学差异，而处理组p-ERK蛋白表达较空白对照组明显增加，且随IL-17浓度增加呈浓度依赖性。

MMPs能够介导几乎所有细胞外基质有效成分的降解，是肿瘤侵袭和转移相关的重要分子。MMP-9是MMPs家族成员，在头颈部癌、消化道癌、卵巢癌等组织中表达异常，预示患者预后不良［10，11］。IL-17可刺激巨噬细胞、单核细胞分泌TNF-α和IL-1，上调巨噬细胞分泌MMP-9。高源等［12］报道，乳腺癌组织中MMP-9表达与p-ERK呈正相关。因此，MAPK/ERK信号转导通路对MMP-9的表达也有一定影响。本研究表明，IL-17可以促进人乳腺癌细胞中MMP-9的表达，且随IL-17浓度增加呈浓度依赖性。随着IL-17浓度增高，p-ERK、MMP-9的表达都随之增加，而总的ERK并没有明显增加，提示p-ERK而不是总的ERK异常激活和表达升高与乳腺癌的侵袭转移有关。表明p-ERK可促进肿瘤细胞MMP-9的表达，从而影响癌细胞浸润转移。

肿瘤的浸润和转移是非常复杂的过程，是多因素多环节形成的，虽然本研究显示IL-17能够增强p-ERK和MMP-9的表达，促进乳腺癌细胞的侵袭转移，但其具体的调节机制仍需进一步研究证实。

表3　各组ERK、P-ERK、MMP-9表达水平比较(n=5，±s)

注:处理组与空白对照组比较，*P＜0.05;处理组间比较，#P＜0.05。

组别MCF-7 p-ERK　ERK　MMP-9 MDA-MB-231 p-ERK　ERK　MMP-9空白对照组　0.39±0.03　1.06±0.07　0.29±0.01　0.49±0.02　1.32±0.14　0.75±0.02 IL-17处理组1 ng/mL　0.57±0.03* #　1.08±0.10　0.34±0.00* #　0.62±0.04* #　1.32±0.18　0.80±0.02* #10 ng/mL　0.73±0.02* #　1.15±0.07　0.36±0.01* #　0.76±0.06* #　1.30±0.12　1.04±0.04* #100 ng/mL　0.88±0.14* #　1.15±0.09　0.57±0.02* #　0.88±0.10* #　1.28±0.10　1.13±0.02*#

参考文献:

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(收稿日期:2014-12-27)

文章编号:1002-266X(2015) 18-0060-03

文献标志码:B

中图分类号:R737.9

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.18.022