突变选择窗内筛选的鲍曼不动杆菌耐药菌株交叉耐药分析

2015-04-04刘明涛李超李凯述滨州市人民医院山东滨州256610

山东医药 2015年18期

刘明涛，李超，李凯述(滨州市人民医院，山东滨州256610)

刘明涛，李超，李凯述
(滨州市人民医院，山东滨州256610)

摘要:目的体外研究不同抗菌药物突变选择窗(MSW)内筛选得到的鲍曼不动杆菌耐药菌株交叉耐药情况，探讨MSW内细菌耐药机制。方法E-test法测定头孢哌酮舒巴坦、亚胺培南西司他丁、阿米卡星、环丙沙星对鲍曼不动杆菌的最低抑菌浓度(MIC)，琼脂平板稀释法测定防耐药突变浓度(MPC)。从每种抗菌药物的MSW内的高浓度与低浓度平板分别挑选单个菌落。用K-B法对耐药菌株进行药敏试验，观察交叉耐药情况。同时应用外排泵抑制剂对筛选出的菌株进行外排泵表型测定，观察有无外排泵激活。结果从亚胺培南/西司他丁与头孢哌酮舒巴坦MSW内筛选的耐药菌无交叉耐药，外排泵抑制试验阳性;环丙沙星与阿米卡星MSW内筛选的耐药菌株有交叉耐药，但仅表现出对同类抗菌药物的交叉耐药，外排泵抑制试验阴性。结论亚胺培南西司他丁与头孢哌酮舒巴坦MSW内的耐药鲍曼不动杆菌发生耐药的机制可能是由于外排泵的激活，不能稳定传代。环丙沙星与阿米卡星MSW内的耐药菌产生耐药基因，可以稳定传代，导致对同类抗菌药物的交叉耐药。临床应用这两种药物治疗效果不理想时，应换用其他类别的抗菌药物治疗。

关键词:突变选择窗;鲍曼不动杆菌;耐药性;药敏试验

鲍曼不动杆菌是院内感染的常见致病菌，由于其对多种抗菌药物耐药，导致临床治疗效果不理想。耐药突变选择窗(MSW)理论认为，当抗菌药物浓度在最低抑菌浓度(MIC)和防耐药突变浓度(MPC)之间(即MSW)时，会使耐药突变菌富集扩增［1，2］。MPC是防止一步耐药突变体富集扩增的最低浓度，当抗菌药物浓度达到或超过MPC时，可抑制耐药突变体的富集扩增。临床应用抗菌药物治疗鲍曼不动杆菌感染时，药物浓度大部分时间落在MSW内，引起耐药突变体的富集扩增，导致治疗失败［3，4］。头孢哌酮舒巴坦、亚胺培南西司他丁、环丙沙星、阿米卡星是临床常用的治疗鲍曼不动杆菌感染的药物［5，6］。2014年1～6月，我们观察了上述四种药物在其MSW内筛选得到的耐药菌株的交叉耐药情况，探讨其耐药机制。

1　材料与方法

1.1材料鲍曼不动杆菌质控菌株ATCC19606，购自卫生部临床检验中心。VITEK-Jr微生物鉴定系统(BioMerieux公司) ;电热恒温培养箱(上海精实实验设备有限公司) ; Vitek比浊仪(法国梅里埃公司) ; E-test纸片(AB Biodisk公司)。Mueller-Hinton (MH)琼脂、MH肉汤为瑞典Oxoid公司产品。头孢哌酮舒巴坦(辉瑞)、亚胺培南西司他丁(默沙东)、环丙沙星(拜耳)、阿米卡星(禾丰制药)。外排泵抑制剂羰基氰化物间氯苯腙(CCCP，Sigma)。

1.2方法

1.2.1抗菌药物MIC测定应用E-test法测定头孢哌酮舒巴坦、亚胺培南西司他丁、阿米卡星、环丙沙星对ATCC19606的MIC。

1.2.2抗菌药物MPC测定［1，2］用无菌生理盐水将孢哌酮舒巴坦、亚胺培南西司他丁、阿米卡星、环丙沙星分别配制成0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64 μg/mL的抗菌溶液，取各浓度的抗菌药物溶液2 mL，分别置入18 mm的无菌平板，加入MH琼脂18 mL，边加边混匀，配制成终浓度为1、2、4、64、128倍MIC浓度的药物琼脂平板。挑取单个菌落接种于200 mL MH肉汤中震荡过夜培养，离心后，悬浮在200 mL MH肉汤中，震荡培养6 h，菌液浓度达(6～9)×109cfu/mL，3 000 r/min离心后，用无菌吸量管准确吸取上清液9 mL，使菌液浓度富集为(6～9)×1010cfu/mL，用比浊仪调整菌液浓度为3×1010cfu/mL。取100 μL菌液均匀涂抹在含有抗菌药物的MH平皿上，每个浓度4个平皿，使每一药物浓度的细菌接种量为1.2×1010cfu。37℃孵育，观察24、48、72 h时的菌落生长情况，以72 h无菌落生长的最低药物浓度为MPC。将接近MPC的两个药物浓度所筛选出的菌株接种至无药物的MH平皿，传代2次后再接种于原筛选药物浓度的平皿上，以确保其是耐药突变株。

1.2.3药敏试验从每种抗菌药物处于MSW内浓度(2倍及8倍MIC)的平板上挑取单个菌落，放入含有牛奶培养基的EP管，低温保存。从EP管中将菌落接种到无药琼脂平板上，培养24 h，取单个菌落，蒸馏水溶解，用比浊仪将菌液浓度调整到0.5个麦氏单位后，均匀涂在无药琼脂平板，贴药敏纸片，24 h后观察抑菌环直径，根据美国临床实验室标准化协会(CLSI)指南2013版判断交叉耐药情况。空白标准菌株组为ATCC19606，对所有抗菌药物均敏感。

1.2.4菌株外排泵表型测定［7］制备CCCP浓度为20 μg/mL的琼脂平板和不含药物的琼脂平板(空白对照)，将筛选出的菌株制备成108cfu/mL的菌液，用无菌棉签均匀涂布于平皿上，E-test法检测鲍曼不动杆菌在不同培养基上对环丙沙星的MIC值。设定以CCCP后环丙沙星MIC较空白对照降低≥4倍的菌株为外排泵表型测定阳性。

2　结果

2.1四种抗菌药物对ATCC19606的MIC、MPC见表1。

2.2药敏试验结果从抗菌药物2倍MIC浓度筛选得到的菌株，其药敏结果显示:从亚胺培南西司他丁和头孢哌酮舒巴坦所筛选的菌株，对所有抗菌药物均敏感;从环丙沙星及阿米卡星所筛选的菌株，对同类药物耐药或中介耐药，其中从环丙沙星所筛选出的菌株对左氧氟沙星、环丙沙星为中介耐药，对氧氟沙星为耐药;从阿米卡星所筛选出的菌株，对庆大霉素、奈替米星为中介耐药，对阿米卡星为耐药。

从抗菌药物8倍MIC浓度筛选得到的菌株，其药敏结果显示:从亚胺培南西司他丁和头孢哌酮舒巴坦所筛选的菌株，与2倍MIC浓度筛选的细菌药敏结构类似，对所有抗菌药物均敏感;从环丙沙星及阿米卡星所筛选的菌株，均表现出对同类药物耐药，而对其他药物均较为敏感;从环丙沙星所筛选出的菌株对左氧氟沙星、环丙沙星、均为氧氟沙星为耐药;从阿米卡星所筛选出的菌株对庆大霉素、奈替米星、阿米卡星均为耐药。

2.3菌株外排泵表型测定结果环丙沙星与阿米卡星组筛选出的耐药突变菌株，在含有CCCP的平板培养后，MIC无明显下降，外排泵表型测定阴性。头孢哌酮舒巴坦与亚胺培南西司他丁组筛选出的耐药突变菌株，在含有CCCP的平板上培养后，对环丙沙星的MIC均下降超过4倍以上，外排泵表型测定阳性。

3　讨论

MPC和MSW理论为防治细菌耐药提供了新的途径。该理论认为，当细菌处在一种抗菌药物的MIC和MPC浓度之间，敏感菌株会被杀灭，而耐药菌株会被选择性富集扩增，导致细菌对该抗菌药物产生耐药。此时产生的耐药菌对其他抗菌药物是否敏感、是否有交叉耐药的情况产生，文献报道较少。我们选择四种对鲍曼不动杆菌较为敏感的抗菌药物头孢哌酮舒巴坦、亚胺培南西司他丁、阿米卡星、环丙沙星，分别在其MSW内的不同浓度筛选出鲍曼不动杆菌耐药菌株进行药敏试验，观察鲍曼不动杆菌耐药菌是否存在交叉耐药现象，结果显示，对于头孢哌酮舒巴坦、亚胺培南西司他丁来说，高浓度和低浓度筛选得到的耐药菌株都没有发生交叉耐药现象，而且对自身也是敏感的。说明从这两种抗菌药物MSW内筛选出的耐药菌株，经过在不含抗菌药物的平板上传代后，其耐药特性不能稳定传代，菌株由耐药又恢复敏感。推测该耐药菌株仅仅是外排泵的激活，而没有发生染色体的改变，而外排泵表型测定试验的结果初步证实了这一推断。有文献报道，对头孢哌酮舒巴及碳青霉烯抗菌药物耐药的鲍曼不动杆菌，与adeABC等外排泵系统的过表达相关［8，9］，在没有药物的平板上传代后，外排泵表型不能稳定传代，作用失活。这也解释了为什么按照MSW理论，临床上应该产生较多耐头孢哌酮舒巴坦、亚胺培南西司他丁的鲍曼不动杆菌，但实际上这种情况并没有出现［10，11］。因此临床治疗鲍曼不动杆菌时，单独应用可以选择头孢哌酮舒巴坦和亚胺培南西司他丁，与其他药物联合应用时，应先选择头孢哌酮舒巴坦、亚胺培南西司他丁，因为这两种药物不会产生交叉耐药，能够取得较好的疗效。

本研究显示，由环丙沙星和阿米卡星MSW筛选出的耐药菌株不但对自身耐药，而且存在交叉耐药现象，但仅表现出对同类抗菌药物交叉耐药，即环丙沙星筛选出的耐药菌株对左氧氟沙星和氧氟沙星中介或耐药，阿米卡星筛选出的耐药菌株对庆大霉素和奈替米星中介或耐药。通过比较抑菌环直径发现，高浓度筛选出的耐药菌株耐药性高于低浓度筛选出菌株。同时外排泵表型测定试验结果为阴性，证实外排泵并没有激活，因此推测耐药的产生并非外排泵激活所致，而是由于耐药基因的出现，尤其是质粒介导的，可以稳定传代，对这类药物产生耐药［12］。因此交叉耐药只出现在同类药物中，而且高浓度筛选出的耐药菌株耐药性更强，其原因是由于耐药基因的累加。因此认为，临床应用环丙沙星和阿米卡星治疗鲍曼不动杆菌感染时，如果疗效不明显，不应换用同类抗菌药物继续使用，而应当换成其他类别的对鲍曼不动杆菌敏感的抗菌药物，如碳青霉烯类或β内酰胺/β内酰胺酶抑制剂，才能取得较好的疗效。

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(收稿日期:2014-11-10)

基金项目:滨州市科技发展计划项目(2011ZC0929)。